Жобаның негізгі идеясы – нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигенін және осы ақуызға моноклоналды антиденелерді алу, сондай-ақ олардың негізінде иммунохроматографиялық талдау жасау. Жоба Қазақстан Республикасында ауылшаруашылық малдары арасында нодулярлық дерматит вирусының таралуына байланысты мәселелерді шешуге бағытталған. Рекомбинантты антиген мен моноклоналды антиденелерге негізделген экспресс-тест жүйесі диагноз қою уақытын 10-20 минутқа дейін қысқартуға мүмкіндік береді. Тест жүйесі нодулярлық дерматитпен ауыратын ірі қара малының қан сарысуындағы вирус пен вирусқа тән антиденелерді анықтауға арналған.
Нодулярлық дерматит – бұл трансшекаралық ауру және мал шаруашылығына үлкен қауіп төндіреді, біздің елімізде де, жалпы әлемде де экономикалық жағдайға үлкен әсер етеді. Екпе егілмеген ірі қара мал бастарының аурушаңдығы 85%-ға, ал өлім-жітімдігі жоғары емес, кей жағдайда 40%-ға жететін. Бүгінгі күнге халықаралық эпизоотиялық бюроның талаптарына сәйкес нодулярлық дерматит жағдайлары міндетті түрде хабарландыруларға жатады. Нодулярлық дерматиттің қоздырғышы каприпоксвирустар тұқымдасына жататын вирус болып табылады, оның құрамына Shippox және Goatpox вирустары да кіреді. Ауру мал өнімділігінің айтарлықтай төмендеуіне, түсік тастауға және кейінгі ұрықтандыру кезіндегі проблемаларға, асыл тұқымды бұқалардың бедеулігіне, терісінің зақымдануына, тірі дене салмағының төмендеуіне, сауықтыру шараларына жұмсалатын шығындарға әкеледі. Вирустың ауру малдан сауға берілуі қансорғыш жәндіктер арқылы жүреді.
Қазақстанда нодулярлық дерматит алғаш рет 2016 жылы Атырау облысында тіркелген. Алдын ала болжам бойынша, вирус көршілес Ресей Федерациясының аумағынан енген, онда нодулярлық дерматит алғаш рет 2015 жылы тіркелген. Аурудың алдын алу үшін 2018 жылы 370 мың бас ірі қара малына екпе егу жүргізіліп, нодулярлық дерматит бойынша эпизоотиялық жағдайға оң әсер етті. Вирустың кең таралуын ескере отырып, ауылшаруашылық малдарының нодулярлық дерматитін диагностикалау үшін рекомбинантты антиген және моноклоналды антиденелер негізінде иммунохроматографиялық тест жасау Қазақстан Республикасы үшін өзекті болып табылады және ғылыми жаңалығы бар.
Зерттеудің соңғы өнімі нодулярлық дерматит диагностикасы үшін иммунохроматографиялық тест болады. Қазіргі уақытта бүкіл әлемде иммунохроматографиялық тест-жүйелер халық шаруашылығының әртүрлі салаларында көбірек қолданылады. Иммунохроматографиялық зерттеулер адам мен жануарлардың жұқпалы және ішкі жұқпалы емес ауруларын, анаша заттарын, азық-түліктердегі антибиотиктерді және т.б. анықтау үшін пайдаланылады. Қазақстан Республикасында иммунохроматографиялық тест-жүйелерді қолдану негізінен жүктілікті анықтауда медицина саласымен шектелгенін атап өткен жөн.
Бұл диагностикалық жүйеге қызығушылықтың артуы тестілеу жүйесінің жылдамдығымен (диагноз 10-20 минут ішінде), тиімділігімен (көп еңбекті немесе далалық жағдайда тексеруге мүмкіндік беретін арнайы жабдықты қажет етпейді) және жаппай тексеру кезінде жеткілікті жоғары арнайылылығы мен сезімталдығымен байланысты. Нодулярлық дерматиттің серологиялық диагностикасы үшін иммунохроматографиялық тест-жүйелердің болуы фермерлерге ауру мал сатып алудан қорғануға және сол арқылы инфекцияның одан әрі таралуына жол бермеуге мүмкіндік береді. Ветеринария мамандары аталмыш тест жүйесін пайдалана отырып, ауру малды дер кезінде анықтап, сол арқылы дер кезінде осы аурудың алдын алу үшін қажетті шараларды қабылдай алады.
Вирустың рекомбинантты Р32 антигені және оған алынған арнайы моноклоналды антиденелер негізінде ірі қара малдағы нодулярлық дерматиттің экспресс диагностикасы үшін иммунохроматографиялық талдау жасау.
Жобаны жүзеге асыру нәтижесінде ауылшаруашылығы малдарының нодулярлық дерматитінің диагностикасы үшін иммунохроматографиялық тест жасалады. Нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигенін өндіретін E. coli микроағзалардың штамдары алынады. Рекомбинантты P32 антигенінің диагностикалық қасиеттері зерттелді. ІҚМ нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигеніне қарсы моноклоналды антиденелер өндіретін гибридті жасушалардың екі желісі алынды. Нодулярлық дерматит вирусының Р32 антигеніне қарсы моноклоналды антиденелердің иммунохимиялық және диагностикалық қасиеттері зерттелді.
Турсунов Канат Ахметович, PhD, h-индекс 3 (Author ID Scopus – 57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017)
Әдіш Жансая Батырбекқызы, биология мамандығының PhD докторанты. Зерттеушінің идентификаторы: AAW-7200-2020; Scopus авторының идентификаторы: 57202535857; ORCID: 0000-0001-9527-8774.
Канаев Дархан Бабанович, биология ғылымдарының магистрі. Зерттеушінің ID: N-6950-2017; ORCID: 0000-0001-9569-9034; Scopus авторының идентификаторы: 278641.
Тохтарова Лаура Әбдіхалыққызы, технология ғылымдарының магистрі. (ORCID: 0000-0003-4386-993X).
1. Borovikov, S., Tursunov, K., Syzdykova, A., Begenova, A., Zhakhina, A. (2023) Expression of recombinant Omp18 and MOMP of Campylobacter jejuni and the determination of their suitability as antigens for serological diagnosis of campylobacteriosis in animals Veterinary World, 16(1), 222–228. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.222-228. Percentile – 80.
2. Tursunov, K., Tokhtarova, L., Kanayev, D., Mustafina, R., and Mukantayev, K. (2022) Effect of thioredoxin on the immunogenicity of the recombinant P32 protein of lumpy skin disease virus, Veterinary World, 15(10): 2384–2390. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2384-2390. Q2. Percentile – 79.
3. Mukantayev, K., Kanayev, D., Zhumabekova, S., Shevtsov, A., Tursunov, K., Mukanov, K., and Ramankulov Y. (2022) Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan, Veterinary World, 15(8): 2067–2071. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2067-2071. Q2. Percentile – 79.
4. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology, 2020, Vol.8, No.4, http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3. Percentile – 46.
5. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K. Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 2019, 27(4), P.85–95. https://doi.org/10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 Q4.
6. Khilyas, I.V., Tursunov, K.A., Shirshikova, T.V., Kamaletdinova, L.K., Matrosova, L.E., Desai, P. T., McClelland, M., Bogomolnaya, L.M. Genome Sequence of Pigmented Siderophore-Producing Strain Serratia marcescens SM6. Microbiology Resource Announcements, 2019, 8(18). https://doi.org/10.1128/mra.00247-19. Q4, Percentile – 29, Citations – 13.
7. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye. M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 73-84. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.9.
8. Adish Zh., Mukantaev K.N., Tursunov K.A., Kaukabayeva G.K., Kanaev D.B., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining and determination of immunogenic properties of TRX-PD-1 recombinant protein. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.3.
9. Bulashev A., Jakubowski T., Mukantayev K., Tursunov K., Kiyan V., Zhumalin A. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis. Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. www.doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
10. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4.
11. Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51. ISSN 1392-2130. Veterinarija Ir Zootechnika (Vet Med Zoot). T. 2018, 76 (98). p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
12. Mukantayev, K., K. Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D. Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4. Percentile – 45.
13. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4, Percentile – 23, Citations – 4.
14. Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product. Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, P.36-42. PMID: 28588631 PMCID: PMC5454577. Q3, Percentile – 45, Citations – 4.
15. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
16. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/OmpBm-Ba продуцент рекомбинантного химерного белка внешней мембраны бруцелл. Удостоверение автора №104361. Булашев А.К., Турсунов К.А., Жумалин А.Х, Мукантаев К.Н.
17. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3) pET28a/Omp19/31 – продуцент химерного рекомбинантного белка внешней мембраны бруцелл. Патент на изобретение № 35776. 29.07.2022. Булашев А.К., Акибеков О.С., Іңірбай Б.Қ., Мукантаев К.Н., Сыздыкова А.С., Сураншиев Ж.А., Турсунов К.А.
18. Генетическая конструкция Pet28/CTLA-4, обеспечивающая продукцию внеклеточного домена рецептора CTLA-4 человека в трансформированных E.coli. Патент на изобретение № 36343. 18.08.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
19. Генетическая конструкция pET32/P32, предназначенная для экспрессии гена Р32 вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Патент на изобретение № 36373. 22.09.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Іңірбай Б.Қ., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
2021 ж.
De novo жағдайында нодулярлық дерматит вирусының антигені үшін P32 генін тасымалдайтын генетикалық құрылым алынды. Алынған ДНҚ фрагменті клондалды және нодулярлық дерматит вирусының P32 генін тасымалдайтын экспрессиялық векторлар негізінде генетикалық құрылымдар алынды. E. coli BL21 (DE3) штамдары молекулалық салмағы 47 кДа (rP32Trx/pET32) және 32 кДа (rP32/pET28) нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигенінің продуценттері алынды. Нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигенін бөліп алу және тазарту әдістері пысықталды. Ақуыздардың аминқышқылдарының реттілігі масс-спектрометрия арқылы тексерілді. Ұсынылған спектрді өңдеу нәтижесінде триптикалық пептидтер жиынтығы нодулярлық дерматит вирусының Р32 ақуызына сәйкес келетіні сенімді түрде көрсетілді.
2022 ж.
Нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты P32 антигенінің иммунологиялық және диагностикалық сипаттамалары зерттелді. Зертханалық жануарларды рекомбинантты Р32 ақуызымен иммундау схемасы оңтайландырылды. ИФТ жанама нұсқасының негізгі параметрлері оңтайландырылды. Р32 рекомбинантты антигеніне қарсы моноклоналды антиденелер өндіретін гибридті жасушалардың екі желісі алынды. Гибридті жасуша желілерінің екеуі де (4E2A11 және 8F2E12) иммуноглобулиндердің G класына, 2b қосалқы класына, жеңіл тізбек типіне – каппаға қатысты антиденелер өндіреді. 4E2A11 және 8F2E12 гибридті жасуша желілері өндіретін моноклоналды антиденелердің байланысу константасы сәйкесінше 3×107M-1 және 2×108M-1 болды. In vitro әдісін қолдану арқылы моноклоналды антиденелердің препараттық мөлшерін өндіру кезінде антидене концентрациясы орташа есеппен 43 мкг/мл құрады. In vivo әдісін қолданып, Balb/c тышқандары желісінде орта есеппен 4-5 мг/мл алынды.
2023 ж.
ІҚМ нодулярлық дерматит вирусының рекомбинантты Р32 антигеніне алынған моноклоналды антиденелердің арнайылылығы анықталды. Иммунохроматографиялық талдауда вирустың Р32 антигеніне рекомбинантты Р32 ақуызын және моноклоналды антиденелерді қолданудың негізгі параметрлері оңтайландырылды. Бөлшектердің өлшемінің диаметрі 20 нм коллоидты алтынға иммобилизациялау үшін ақуыз G (рН 6,0) және моноклоналды антиденелердің (рН 9,0) оңтайлы концентрациясы сәйкесінше 20 мкг/мл және 12 мкг/мл екені анықталды. Мембранаға жұқтырылатын моноклоналды антиденелердің, антигеннің және қосалқы антитүрлі антиденелердің оңтайлы концентрациясы сәйкесінше 200 мкг/мл, 500-800 мкг/мл және 200-300 мкг/мл құрайды. Конъюгат пен моноклоналды антиденелер рекомбинантты P32 ақуызымен арнайы байланысатын және басқа ақуыздармен қиылыс реакцияға түспеген. Иммунохроматографиялық тесттерді қалыптастыру параметрлері пысықталды және оның диагностикалық қасиеттері анықталды. Тесттің сезімталдығы 79%, арнайылылығы 90% болды.