Основная идея проекта заключается в получении рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита и моноклональных антител к данному белку, а также разработка на их основе иммунохроматографического анализа. Проект направлен на решение проблем с распространением вируса нодулярного дерматита сельскохозяйственных животных в Республике Казахстан. Экспресс тест-система на основе рекомбинантного антигена и моноклональных антител позволит сократить время постановки диагноза до 10-20 минут. Тест-система предназначена для выявления вируса и специфических к вирусу антител в сыворотке крупного рогатого скота больных нодулярным дерматитом.

Актуальность

Нодулярный дерматит является инфекционным заболеванием сельскохозяйственных животных и имеет важное экономическое значение. Экономические потери связаны со снижением продуктивности крупного рогатого скота и снижением качества молока, бесплодием и абортами, повреждениями шкур, а иногда и смертью в следствии вторичных бактериальных инфекций.

Заболевание характеризуется лихорадкой, формированием на коже и слизистых оболочках узелков от 2 до 5 см в диаметре, поражениями дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта и увеличенными поверхностными лимфатическими узлами. Считается, что нодулярный дерматит передается среди крупного рогатого скота посредством укусов насекомых (таких как комары, мухи и клещи).

В Казахстане нодулярный дерматит впервые был зарегистрирован в 2016 году в Атыруской и Западно-Казахстанской областях. Клинические признаки заболевания отмечались у 6 200 голов крупного рогатого скота, при этом процент падежа составил 12,7% (790 голов) [5]. В 2017 году инфекция отмечалась в Костанайской и Актюбинской областях, в 2018 году в Карагандинской области. Для профилактики заболевания в 2018 году были вакцинированы 370 тыс. голов крупного рогатого скота оказавшее положительное влияние на эпизоотическую обстановку по нодулярному дерматиту крупного рогатого скота. Учитывая широкую распространённость вируса разработка иммунохроматографической тест-системы на основе рекомбинантного антигена и моноклональных антител для диагностики нодулярного дерматит сельскохозяйственных животных является актуальной для Республики Казахстан и обладает научной новизной.

Конечным продуктом исследования будет иммунохроматографическая тест-система для диагностики нодулярного дерматита. В настоящее время иммунохроматографические тест-системы в мире находят все большее применение в различных отраслях народного хозяйства. Иммунохроматографические тест-системы применяют для определения инфекционных и внутренних не заразных болезней человека и животных, наркотиков, антибиотиков в продуктах питания и т.д. Необходимо отметить, что в Республике Казахстан применение иммунохроматографических тест-систем в основном ограничилось медицинской сферой при определении беременности.

Повышенный интерес к данной диагностической системе связан с экспрессностью тест-системы (диагноз в течение 10-20 минут), эффективностью (не требует больших трудозатрат и специализированного оборудования, что позволяет проводить обследование в полевых условиях), и достаточно высокой специфичностью и чувствительностью при массовом обследовании. Наличие иммунохроматографических тест-систем для серологической диагностики нодулярного дерматита позволит фермерам оградить себя от приобретения больного скота и тем самым предотвратить дальнейшее распространение инфекции. Ветеринарные специалисты с помощью данной тест системы смогут своевременно выявлять больных животных и тем самым вовремя принять необходимые меры  для предотвращения распространения данного заболевания.

Цель

Разработка иммунохроматографического анализа для экспресс-диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота на основе рекомбинантного  Р32 антигена вируса и полученных к нему специфичных моноклональных антител.

Ожидаемые результаты

В результате реализации проекта будет разработана иммунохроматографическая тест-система для диагностики нодулярного дерматита сельскохозяйственных животных. Будут получены штаммы микроорганизмов Е. coli продуцирующие рекомбинантный РЗ2 антиген вируса нодулярного дерматита. Изучены диагностические свойства рекомбинантного РЗ2 антигена. Получены 2 линии гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного РЗ2 антигена вируса нодулярного дерматита КРС. Изучены иммунохимические и диагностические свойства моноклональных антител против Р32 антигена вируса нодулярного дерматита.

Руководитель проекта

Турсунов Канат Ахметович, PhD, h-индекс 1 (Author ID Scopus — 57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017)

Члены исследовательской группы:

Унышева Гульхан Бекбергеновна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунохимии и иммунобиотехнологии, НЦБ.

Каукабаева Гульдаригаш Куанышовна, магистр технологических наук, (Author ID Scopus — 57211579303, Researcher ID Web of Science N-8977-2017)

Әдіш Жансая Батырбекқызы, PhD докторант по специальности биологии, (Author ID Scopus — 57202535857)

Іңірбай Бақыткали Қабиұлы, PhD докторант, h-индекс 1 (Author ID Scopus — 57193571536)

Канаев Дархан Бабанович, магистр биологических наук, (Researcher ID Web of Science N-6950-2017)

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product. Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, P.36-42. PMID: 28588631 PMCID: PMC5454577. Q3. Цитирование
2. Bulashev A., Jakubowski T., Mukantayev K., Tursunov K., Kiyan V., Zhumalin A. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis. Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
3. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4.
4. Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51. ISSN 1392-2130. Veterinarija Ir Zootechnika (Vet Med Zoot). T. 2018, 76 (98). p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
5. Mukantayev, K., K. Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D. Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4.
6. Mukantaev KN, Kairova Zh., Tursunov KA, Zhumabekova SH., Ramankulov EM, Mukanov K.K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis. Current Topics in Peptide and Protein Research. – 2019. – Vol.20. http://www.researchtrends.net/tia/article_pdf.asp?in=0&vn=20&tid=26&aid=6375. Q4.
7. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K. Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 2019, 27(4), P.85–95. https://doi.org/10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 Q4.
8. Khilyas, I.V., Tursunov, K.A., Shirshikova, T.V., Kamaletdinova, L.K., Matrosova, L.E., Desai, P. T., McClelland, M., Bogomolnaya, L.M. Genome Sequence of Pigmented Siderophore-Producing Strain Serratia marcescens SM6. Microbiology Resource Announcements, 2019, 8(18). https://doi.org/10.1128/mra.00247-19.
9. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology, 2020, Vol.8, No.4, http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3.
10. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye. M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 73-84. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.9.
11. Adish Zh., Mukantaev K.N., Tursunov K.A., Kaukabayeva G.K., Kanaev D.B., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining and determination of immunogenic properties of TRX-PD-1 recombinant protein. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.3.
12. Tursunov, K., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K., Ramanculov, E., Shustov, A., Mukantayev, K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product. Iranian Journal of Veterinary Research, 2017, 18(1), 36–42. https://doi.org/10.22099/ijvr.2017.4028
13. Mukantayev, K., Tursunov, K., Raimbek, G., Shustov, A., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Ramanculov, E. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 34–40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
14. Mukantayev, K., Tursunov, K., Ingirbay, B., Adish, Z., Azhibayeva, M., Kairova, Z., Shustov, A. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 2018, 24(3), 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4.
15. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K. Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 2019, 27(4), P.85–95. https://doi.org/10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 Q4.
16. Aitbay Bulashev, Orken Akibekov, Zhanbolat Suranshiyev, Bakytkali Ingirbay, Saule Z. Eskendirova. Serodiagnostic potential of Brucella outer membrane and periplasmic proteins. Turk J Vet Anim Sci, 2019, 43: 486-493. https://doi.org/10.3906/VET-1902-75
17. Adish Zh., Mukantaev K.N., Tursunov K.A., Kaukabayeva G.K., Kanaev D.B., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining and determination of immunogenic properties of TRX-PD-1 recombinant protein. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.3.
18. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye. M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 73-84. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.9.
19. Kanaev D.B., Mukanov K.K., Adish Zh., Tokhtarova L., Zhumabekova S., Ingirbay B., Tursunov K.A., Ramankulov Ye.M., Mukantayev K.N. Obtaining recombinant extracellular fragments of GPR161 receptor. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.4.
20. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology, 2020, Vol.8, No.4, http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3.
21. Aitbay Bulashev, Orken Akibekov, Alfiya Syzdykova, Zhanbolat Suranshiyev and Bakytkali Ingirbay. Use of recombinant Brucella outer membrane proteins 19, 25, and 31 for serodiagnosis of bovine brucellosis. Veterinary World, 2020, 13(7): 1439-1447. doi: www.doi.org/10.14202/vetworld.2020.1439-1447.
22. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ15/3А — продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. Инновационный патент №25095. Мукантаев К.Н., Турсунов К., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Харлампиева Д.Д., Кущева Н.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
23. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 — продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа А. Авторское свидетельство №90924. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
24. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/Е3.pET22/gp51 продуцент рекомбинантного gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение №30998. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
25. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/МPRV продуцент рекомбинантного матричного белка вируса бешенства. Удостоверение автора №106743. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
26. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
27. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/OmpBm-Ba продуцент рекомбинантного химерного белка внешней мембраны бруцелл. Удостоверение автора №104361. Булашев А.К., Турсунов К.А., Жумалин А.Х, Мукантаев К.Н.

Достигнутые результаты

2021 г.

В условиях de novo получена генетическая конструкция несущая ген Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Проведено клонирование полученного фрагмента ДНК и получены генетические конструкции на основе экспрессионных векторов несущих ген Р32 вируса нодулярного дерматита. Получены штаммы E. coli BL21 (DE3) продуценты рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита с молекулярной массой 47 кДа (rР32Trx/рЕТ32) и 32 кДа (rP32/рЕТ28). Были отработаны методы выделения и очистки рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Аминокислотную последовательность белков проверяли методом масс-спектрометрии. В результате обработки представленного спектра было достоверно показано, что набор триптических пептидов соответствует белку Р32 вируса нодулярного дерматита.

2022 г.

Изучены иммунологические и диагностические характеристики рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Отработана схема иммунизации лабораторных животных рекомбинантным Р32 белком. Оптимизированы основные параметры постановки непрямого варианта ИФА.