Жоба шеңберінде Қазақстаннан келген пациенттерде ауыр зардаптар туғызған SARS-CoV-2 нұсқаларын секвенирлеу әдісімен генетикалық сипаттауды жүргізу жоспарлануда. Эпидемияның дамуына қарай қазақстандықтардың популяциясында вирустың маңызды бір нуклеотидті полиморфизмдерінің таралуының өзгеруі зерттелетін болады.Бірнеше пациенттің ауру дамуының әртүрлі кезеңдерінде вирустың субгеномдық РНҚ скринингі жүргізіледі. Сондай-ақ жоба аясында вакциналарды диагностикалау және әзірлеу мақсаттары үшін ең перспективалы нысаналар болып табылатын SARS-CoV-2 полипептидтерін оқудың ашық шеңберлері клондалады. Клондалған кднқ бактерияларда экспрессияланады, ал синтезделген рекомбинантты ақуыздар оқшауланып, тазартылады. Алынған нәтижелер диагностикаға, теруге және болжауға арналған ПТР және ИФА негізіндегі отандық COVID-19 тест-жүйелерді құруға негіз болады.

Өзектілігі

SARS-CoV-2 геномының өзгергіштігі жақын арада осы вирусқа арналған вакциналар мен диагностикалық құралдардың тиімділігіне теріс әсер етуі мүмкін. Сондықтан ауруды бақылау жүйесін жоғары деңгейде ұстап тұру үшін вирустың қандай генетикалық нұсқалары әр түрлі популяцияларда таралатынын үнемі қадағалап отыру қажет.Вирус геномдарының генетикалық өзгергіштігін бағалаудың бірнеше тәсілдері бар.

Бірінші тәсіл бүкіл вирустық геномды оқуға және геномдық кітапханаларды одан әрі талдауға негізделген. Бұл тәсіл жиі кездесетін полиморфизмдерді тез анықтауға мүмкіндік береді. Толық геномды секвенирлеу-бұл өте қымбат және күрделі талдау әдісі; жақында ол әдетте жаңа буын секвенирлерінде (NGS) жасалады [19, 21].

Екінші тәсіл вирустық геномның ең маңызды учаскелерін ішінара ретке келтіруді қамтиды. Бұл тәсіл ресурстарды айтарлықтай үнемдеуге және геномның ең Ақпараттық аймақтарына ғана назар аударуға мүмкіндік береді. SARS-CoV-2 өзгергіштігін зерттеушілер негізгі мақсат ретінде әдетте s ақуыз генін таңдайды (жоғары өзгермелі): бұл вирусты бейтараптандыратын антиденелердің ең көп өндірілетін SARS-CoV-2 s ақуызында [23, 24], коронавирустардың негізгі беткі ақуызындағы азаменттер оның антиденелермен байланысуына әсер етуі мүмкін. Ақуызға және оның жеке учаскелеріне сүйене отырып, ең көп кандидаттық суббірлікті және векторлық рекомбинантты вакциналар әзірленетіні маңызды [22]. Вирустарда S протеинінен басқа M және N құрылымдық белоктары иммундоминантты болып табылады: бұл үш ақуызда MHCI және MHCII презентациясы үшін эпитоптардың ең көп саны бар [25-26]. Нуклеокапсидті ақуыз N- бұл үш ақуыздың ішіндегі ең иммунодоминантты және ең консервативті болып табылады. Сонымен қатар, ол гликозилденуге бейім емес. Оның бұл сипаттамалары оны SARS-CoV-2 детекциясы үшін Elisa негізіндегі сынақ жинақтарын жасау үшін ыңғайлы нысанаға айналдырады. Көбінесе бұл SARS-CoV-2 РНҚ-ны ПТР арқылы анықтау үшін нысана ретінде таңдалатын N ақуыз гені [27-29] басқа коронавирустық гендермен салыстырғанда оның сақталуына және ең жоғары көшірмесіне байланысты (гРНҚ-дағы N генінің 3’терминалды дислокациясына байланысты, ол вирустың барлық гРНК-ларында да бар) [30].

SARS-CoV-2 геномдарын генетикалық сипаттаудың үшінші тәсілі адам популяциясында ПТР немесе нуклеин қышқылын будандастыруға негізделген жылдам, талдауға ыңғайлы әдістерді қолдана отырып, бұрыннан қалыптасқан нақты полиморфизмдерді (көбінесе бір нуклеотидті, SNP) анықтауды қамтиды.

Осы жобада Қазақстан аумағында айналымда жүрген SARS-CoV-2 генотиптерін генетикалық сипаттау үшін жоғарыда аталған барлық үш тәсілді пайдалану жоспарлануда. Үлгілердің шектеулі саны үшін толық геномдық реттілік MinION (OxfordNanoporeTechnologies) платформасын пайдалану арқылы жүзеге асырылады деп жоспарлануда. Сэнгер әдісімен ішінара (мақсатты) секвенирлеуді ең ауыр клиникалық көріністері, соның ішінде өлім-жітімі бар пациенттерден бөлінген үлгілер үшін жүргізу жоспарлануда. Нүктелік SNP (мысалы, 241C/T және 23403A/G) көптеген ПТР оң үлгілерінде анықталады. Зерттеудің жаңалығы, ең алдымен, қазақстандықтардан алынған үлгілер талданатын болады.

Ұсынылған жоба аясында коронавирустың генетикалық ғана емес, субгенетикалық сипаттамаларын да талдау жоспарлануда. Вирустың белсенді репликациясы және коронавирустық сгРНҚ дамуы негізінен виремия сатысында байқалатындықтан, сгРНҚ SARS-CoV-2 коронавирустық инфекция сатысын белгілеу үшін маркер ретінде пайдаланылуы мүмкін деген болжам жасалды [31]. COVID-19 вспеттері кезінде ауруханалар жиі толып кетеді, ал коронавирустық РНҚ – ның қалдық мөлшері адам ағзасында ұзақ уақыт тұра алады және ПТР-ға оң жауап бере алады, тіпті пациенттің денесінде белсенді болса да, белгілі бір Т және В жасушаларының иммундық реакциясы және вирустың көбеюі тоқтайды, бұл басқа адамдарға жұқтыру мүмкіндігін азайтады. Сондықтан биомаркерлердің бұл түрі инфекциялық әлеуеті төмен емделушілерден ерекше жұқпалы науқастарды ажырату үшін жаңа инфекцияны бақылаумен айналысатын медицина қызметкерлеріне баға жетпес көмек көрсете алады. Сонымен қатар, жаңа коронавирустың sgrna-лары жасушалардың жасуша мембранасымен байланысты болуы мүмкін, бұл оларды бұрын ойлағаннан да тұрақты етеді [32]. Жоба SARS-CoV-2 сгРНҚ анықтау үшін отандық сынақ жүйесін әзірлеудің орындылығын анықтау үшін коронавирустық инфекцияның сатысын анықтау үшін биомаркер ретінде әртүрлі субгеномдық РНҚ-ларды пайдаланудың дұрыстығын тексеруді жоспарлап отыр. Осы зерттеу барысында праймерлер мен өз дамуының сынамаларын пайдалану жоспарлануда, сонымен бірге бір емес, бірнеше түрлі sgrna-ны анықтау керек. Жоба шеңберінде жүргізілген зерттеулер COVID-19 анықтау және(немесе) болжау үшін ПТР және ИФА негізіндегі әртүрлі отандық тест-жүйелерді әзірлеу үшін негіз болады.

Мақсаты

2020 жылғы пандемия кезінде Қазақстанда айналымда болған SARS-CoV-2 генотиптеріне қатысты популяциялық зерттеулер жүргізу, олардың субгеномдық сипаттамаларына талдау жасау және COVID-19 диагностикасына ғылыми негізделген тәсілдерді әзірлеу үшін рекомбинантты SARS-CoV-2 ақуыздарын алу.

Күтілетін нәтижелер

Жобаны іске асыру барысында мынадай тікелей ғылыми нәтижелер алынатын болады:

-SARS-CoV-2 отандық генотиптерінің геном фрагменттері бар ДНҚ құрылымдары;

-SARS-CoV-2 мақсатты кДНҚ гендерін білдіретін E. coli экспрессиялық штамм сызықтары;

– SARS-COV-2 тазартылған рекомбинантты ақуыздар;

-SARS-CoV-2 теруге және оның субгеномдық РНҚ-сын анықтауға арналған жаңа праймерлер мен флуоресцентті таңбаланған зондтар.

Жобаны іске асыру барысында алынған нәтижелер COVID-19 диагностикасы мен болжамының тиімділігін арттыру үшін қандай отандық тест-жүйелерді әзірлеу керектігін анықтауға мүмкіндік береді. Қазақстанда эпидет дамуының әр түрлі кезеңдерінде айналымда болатын жаңа коронавирустың генотиптері туралы деректер алынады. Жобаны іске асыру барысында әзірленген праймерлер мен сынамалар, сондай-ақ вирустық геномның тасымалдаушы учаскелері бар генетикалық құрылымдар SARS-CoV-2 анықтау және теру, сондай-ақ аурудың ауырлығын болжау үшін отандық RT-qPCR негізіндегі сынақ жүйелерін әзірлеу үшін пайдаланылуы мүмкін. Оқшауланған рекомбинантты ақуыздарды SARS-CoV-2 антиденелерін анықтау үшін отандық ИФА негізіндегі сынақ жүйесін әзірлеу үшін пайдалануға болады.

Жоба жетекшісі

Скиба Ю.А., жоба жетекшісі, биология ғылымдарының кандидаты (молекулалық биология). Хирш Индексі: 6. ORCID: http://orcid.org/0000-0003-4895-1473. Scopus ID: 56677594900. WoSID: H-6528-2017.

Орындау тобының мүшелері:

Низкородова А.С., биология ғылымдарының кандидаты (молекулалық биология). Хирш Индексі: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1597-7207. Scopus ID: 57215971184. WoSID: AAY-1646-2020.

Дмитровский А.М., медицина ғылымдарының докторы, профессор, зертхана меңгерушісі, инфекционист дәрігер. Хирш Индексі: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4714-3079. ScopusID: 57204864464. WoSID: AAZ-2816-2020.

Исмагулова Г.А.  – биология ғылымдарының кандидаты (молекулалық биология). Хирш Индексі: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2735-4939. ScopusID: 6506396016. WoSID: AAO-3437-2020.

Бердыгулова Ж.А., PhD-докторант (биотехнология), вирусология және молекулалық биология саласындағы маман. Хирш Индексі: 4. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0379-2472. Scopus ID: 23977664200. WoS ID: I-2943-2018.

Неупокоева А.С., биотехнология саласының магистрі.  Индекс Хирша: 1. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7257-8037. ScopusID: 57217703182. WoSID: N-9341-2017.

Березовский Д.В., магистр (медицина), врач гигиенист-эпидемиолог. Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2830-1994. ScopusID: 57212528777. WoSID: AAY-6245-2020.

Найзабаева Д.А., биотехнология мамандығының магистрі.ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0606-4289. Scopus ID: 57218288692.WoS ID: AAY-5696-2020.

Жоба жетекшісі мен зерттеу тобының мүшелерінің жоба тақырыбы бойынша жарияланымдары

1. SkibaY.; MokrousovI.; NabirovaD.; Ismagulova G.,et al. Mycobacterium tuberculosis RD-Rio Strain in Kazakhstan. Emerg. Infect. Dis. 2019;25(3):604-606. https://doi.org/10.3201/eid2503.181179. IF 6.259; Q1; Cite score 8.8; SJR 2.72; percentile 94. 
2. Perfilyeva Y.V., ShapiyevaZ.Zh., Ostapchuk Y.O., Berdygulova Z.A., Bissenbay A.O., Kulemin M.V., Ismagulova G.A., Maltseva E.R., Skiba Y.A.,Sayakova Z.Z., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Tick-borne pathogens and their vectors in Kazakhstan – a review. Ticks and Tick-borne diseases. 2020;11(5):101498. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101498.IF 2.749; Q2; Cite score 5.2; SJR 1.182; percentile 95. 
3. Ismagul A., Yang N., Maltseva E.,Skiba Y., et al. A biolistic method for high-throughput production of transgenic wheat plants with single gene insertions. BMC Plant Biology. 2018;18:135. https://doi.org/10.1186/s12870-018-1326-1. IF 3.497; Q1; Cite score 5.0; SJR 1.485; percentile 87. 
4. Mokrousov I.,Chernyaeva E.,Vyazovaya A.,Skiba Y., et al. Rapid Assay for Detection of the Epidemiologically Important Central Asian/Russian Strain of the Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype. J Clin Microbiol. 2018;56(2):e01551-17. https://doi.org/10.1128/JCM.01551-17. IF 5.897; Q1;Cite score 8.6; SJR 2.601; percentile 91. 
5. Mokrousov I., Shitikov E., Skiba Y. et al. Emerging peak on the phylogeographic landscape of Mycobacterium tuberculosis in West Asia: Definitely smoke, likely fire. Mol PhylogenetEvol. 2017;116:202-212. doi: 10.1016/j.ympev.2017.09.002. IF 3.496; Q2; Cite score 7.1; SJR 1.645; percentile 93. 
6. Mokrousov I, Vyazovaya A, Iwamoto T, Skiba Y et al. Latin-American-Mediterranean lineage of Mycobacterium tuberculosis: Human traces across pathogen’s phylogeography. Mol PhylogenetEvol. 2016,99:133-143. doi: 10.1016/j.ympev.2016.03.020. IF 3.496; Q2;Cite score 7.1; SJR 1.645; percentile 93.
7. Skiba Y.,Mokrousov I., Ismagulova G.,Maltseva E., et al. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: A country-wide study. Tuberculosis. 2015;95(5): 538-546. https://doi.org/10.1016/j.tube.2015.04.012. IF 2.576; Q3;Cite score 4.5; SJR 1.026; percentile 68.
8. Султанов А.А., Егорова Н.Н., Скиба Ю.А., Даугалиева А.Т. Инновационный патент РК № 30443 “Способ определения микроорганизмов рода Salmonella”. 15.10.2015. Бюл.№10.
9. Abdiyeva K., Turebekov N., Dmitrovsky A., et al. Seroepidemiological and molecular investigations of infections with Crimean–Congo haemorrhagic fever virus in Kazakhstan. Int.J.Inf.Dis. 2019;78:121-127. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2018.10.015. IF 3.202; Q2.
10. Turebekov N., Abdiyeva K., Yegemberdiyeva  R., Dmitrovsky A., et al. Prevalence of Rickettsia species in ticks including identification of unknown species in two regions in Kazakhstan. Parasites and Vectors. 2019;12:197. https://doi.org/10.1186/s13071-019-3440-9.IF 2.824; Q1.
11. Head J.R., Bumburidi Y., Mirzabekova G., Berezovskiy D., et al. Risk Factors for and Seroprevalence of Tickborne Zoonotic Diseases among Livestock Owners, Kazakhstan. Emerg Infect Dis. 2020;26(1):70-80.https://dx.doi.org/10.3201/eid2601. IF 6.259; Q1.
12. Kiseleva I.V., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Larionova N.V., Dubrovina I.A., Berdygulova Z.A., et al. Genome Composition Analysis of Reassortant Influenza Viruses Used in Seasonal and Pandemic Live Attenuated Influenza Vaccine. 2011;26(4):174-185. IF 0.25; Q4.
13. Berdygulova Z., Esyunina D., Miropolskaya N., et al. A novel phage-encoded transcription antiterminator acts by suppressing bacterial RNA polymerase pausing. Nucleic Acids Research. 2012;40(9):4052-4063.https://doi.org/10.1093/nar/gkr1285. IF 11.501; Q1.
14. Berdygulova Z., Westblade L.F., Florens L., et al. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus bacteriophage. J.Mol.Biol. 2011;405(1):125-142. IF 4.76; Q1.
15. Minakhin L., Goel M., Berdygulova Z., et al. Genome Comparison and Proteomic Characterization of Thermus thermophilus Bacteriophages P23-45 and P74-26: Siphoviruses with Triplex-forming Sequences and the Longest Known Tails. J.Mol.Biol. 2008;378(2):468-480. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.02.018. IF 4.76; Q1.
16. Zhigailov A.V. Alexandrova A.M., Nizkorodova A.S., et al. Evidence that phosphorylation of the alpha-subunit of eIF2 does not essentially inhibit mRNA translation in wheat germ cell-free system. Frontiers in Plant Science. 2020;11:936. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00936. IF 4.402; Q1.
17. Nizkorodova A., Suvorova M., Zhigailov A., Iskakov B. The effect of translation promoting site (TPS) on protein expression in E. coli cells. Mol.Biotechnol. 2020.62(6-7):1-9. .https://doi.org/10.1007/s12033-020-00251-1.IF 2.022; Q3.
18. Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Perfilyeva Y.V., Shumilina A.G., Yeraliyeva L.T., Nizkorodova A.S., Kuznetsova T.V., Iskakova F.A., Berdygulova Z.A., Neupokoyeva A.S., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Two case reports of neuroinvasive West Nile Virus infection in the Almaty region, Kazakhstan. IDCases. 2020;21:e00872. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2020.e00872. SJR 0.294.

Қол жеткізілген нәтижелер

2021 жыл

Ауру ағымының ауыр түрі бар Қазақстандықтардың үлгілерінен, патологиялық материалдан алынған үлгілерден оқшауланған РНҚ-мен SARS-CoV-2 геномын ішінара секвенирлеу жүргізілді.

MEGA-X бағдарламасында SARS-CoV-2 генінің ЕАР нуклеотидтер тізбегін талдау және RNA-structure бағдарламасында праймерлер мен дуплекстердің қайталама құрылымын талдау негізінде праймерлер әзірленді; праймерлер ҚР БҒМ ҒК “ҰБО” РМК Органикалық синтез зертханасында синтезделді және тазартылды. ПТР-дан оң РНҚ үлгілері үшін SARS-CoV-2 адгезиялық ақуызының бүкіл ЕАР қамтитын бірегей ұзақ күшейтулер алынды, сонымен қатар CoV-Lead-F/RvS праймер жұбын және FwS/Sfull_Kpn_R праймер жұбын пайдалану кезінде берілген ЕАР толығымен қабаттасатын екі күшейту алынды. Амплификацияларды тазартқаннан кейін синтезделген праймерлерді қолдана отырып, Сэнгер секвенирлеу реакциясы жүргізілді.

Аурудың ауыр түрі бар пациенттерден, патологиялық материалдан алынған үлгілерден, COVID-19 жұқтырған және аурудың орташа ағымы бар жаңа коронавирустық инфекцияны қайта жұқтырған адамдардан, сондай-ақ covid 19 жұқтырған және ауыр ауру белгілерін көрсеткен вакцинацияланған адамдардан алынған үлгілерді ретке келтіру жүргізілді. Он екі РНҚ – оң сынамалар үшін ридтер беткі гликопротеиннің (адгезиялық ақуыз s) толық ЕАР тізбегін жауып тастады. Барлық он бір нұсқада 23403a > G мутациясы анықталды (нәтижесінде s ақуызындағы d614g аминқышқылдарының алмастырылуы). Бір үлгіде 23403a > G ауыстырудан басқа, 23208 позициясында А/С нуклеотидтерінің қоспасы анықталды. жеті үлгідегі ақуыздың ЕАР s нуклеотидтер тізбегі бастапқы “Ухань” генетикалық нұсқасынан еш айырмашылығы жоқ. Үш үлгінің тізбегінде SARS-CoV-2 (S: HV69-70del; S: Y144del; S: N501Y; S: A570D S: D614G; S: P681H; S: T716I; S: S982A; S: D1118H) Британдық альфа штаммына тән барлық алмастырулар болды. Үлгілердің бірінде S:T716I алмастырудан басқа осы мутациялардың барлығы (ДДҰ классификациясы бойынша вирустың альфа штаммына тән) болды. осы он екі адгезиялық ақуыз ЕАР тізбегі GenBank ncbi базасына орналастырылған (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank): GenBank c нөмірлері OK354348 бойынша OK354359.

2022 жыл

SARS-CoV-2 аса маңызды бір нуклеотидті полиморфизмдерді (SNP) анықтау бойынша Қазақстанда COVID-19 эпидемиясының дамуының әр түрлі кезеңдерінде іріктелген ПТР-оң үлгілерге скрининг жүргізілді.

-Классикалық RT-PCR (SNP, жою және инсерцияны анықтау) және RT-qPCR (SNP) әдісімен ең маңызды SARS-CoV-2 мутацияларын анықтау үшін праймерлер мен сынамалардың дизайны жүргізілді. Олардың de novo синтезі және HPLC әдісімен тазарту жүргізілді.

-2020 жылғы 01 сәуірден 2022 жылғы 30 сәуірге дейінгі кезеңде пациенттерден алынған COVID-19 бойынша РНҚ-ның RT-PCR-оң  іріктеуі жүргізілді.

-RT-qPCR әдісімен SARS-CoV-2 адгезиялық ақуызының фуринді танитын учаскесін кодтайтын S генінің учаскесіндегі алғашқы маңызды мутацияға скрининг жүргізілді.

– Классикалық RT-PCR әдісімен VOCs нұсқаларын бір-бірінен және VOC-қа жатпайтын нұсқалардан ажырату үшін мутациялар скринингі жүргізілді.

SARS-CoV-2 ең маңызды бір нуклеотидті полиморфизмдерді (SNP) ПТР әдісімен анықтау үшін праймерлер мен зондтар әзірленді, синтезделді және тазартылды.

– ДДҰ нотификацияланатын (VOCs) ретінде бекіткен генетикалық нұсқалардың нуклеотидтер тізбегі, атап айтқанда альфа (B. 1.1.7), бета (B1.351), гамма (B. 1.1.248), дельта (B. 1.617+) және омикрон (B. 1.1. 529).

– SARS-CoV-2 VOCs барлық бес генетикалық нұсқаларын классикалық ПТР әдісімен ажыратуға мүмкіндік беретін ең маңызды мутацияларды (SNP, жою және инсерция) анықтау үшін праймерлер әзірленіп, синтезделіп, тазартылды.

-RT-qPCR (нақты уақыттағы ПТР) әдісімен “23403A > G” (S: D614G) мутациясын анықтау үшін праймерлер мен зонд таңдалып, синтезделіп, тазартылды.

Қазақстанда эпидемия дамуының әртүрлі кезеңдерінде келіп түскен үлгілерден оқшауланған вирустық РНҚ-ны ПТР-типтеу жүргізілді.

-Пандемияның бастапқы кезеңінде (2020 жылғы сәуір-қыркүйек) елу ҚТ-ПТР оң бейнелерде 23403a > G” (S: D614G) мутациясын анықтау бойынша талдау жүргізілді. Мутациясы жоқ бір ғана үлгі (ең ерте) анықталды.

-COVID-19 пандемиясының дамуының әртүрлі кезеңдерінде ең төменгі Ct мәні бар RT-qPCR бойынша оң жауап берген үлгілердің (екі жүз пациенттен) репрезентативті үлгісі жасалды.

– SARS-CoV-2 белгілі бір VOC-қа жататындығына немесе жатпайтындығына қатысты 200 ПТР-оң бейнелерді типтеу жүргізілді. Гамма нұсқасы (B. 1.1.248) анықталған жоқ. Бір ғана бета нұсқасы анықталды (B1.351). Альфа нұсқасының 37 үлгісі (B. 1.1.7), дельта нұсқасының 25 үлгісі (B. 1.617+) және омикрон нұсқасының 39 үлгісі (B. 1.1.529) анықталды.

-SARS-CoV-2 генетикалық нұсқалары бойынша электрондық база құрылды.

2023 жыл

– Әдеби деректер негізінде вакциналарды диагностикалау және әзірлеу үшін спайк протеині S, мембраналық ақуыз М, нуклеопротеин N, құрылымдық ақуыз E ең қолайлы SARS-CoV-2 полипептидтері таңдалды. Vector Nti 11.0 бағдарламасында нотификацияланатын негізгі коронавирустық құрылымдық ақуыздарды кодтайтын вирустық геном учаскелерінің генетикалық нұсқалар (альфа, бета, гамма, дельта, омикрон) және бастапқы генетикалық нұсқа нуклеотидтер тізбегі талданды. SARS-CoV-2 негізгі генетикалық нұсқалары арасындағы ең аз генетикалық айырмашылықтары бар аймақтар таңдалды, сонымен қатар барлық нуклеотидтер тізбегі белгілі бір шектеу орындарының болуына талданады. Жоғарыда аталған SARS-CoV-2 ЕАР-ті клондау үшін праймерлер, E. coli pET23c экспрессиялық векторына сай клондауға арналған рестрикция сайттары әзірленді. Барлық праймерлер синтезделіп, тазартылды.

– ИФА-жиынтықтары үшін әлеуетті нысаналарды әзірлеу мақсатында S адгезиялық беткі гликопротеидінің, мембраналық ақуыздың М, нуклеопротеиннің N және порин Е ақуызының ЕАР клондалған. S ақуызының ЕАР клондау үшін тек S протеинінің экстрамембраналық локализациясы бар бөлігін кодтайтын кДНҚ пайдаланылды. ПТР жоғары дәлдіктегі ферментті қолдана отырып жүргізілді. Тазартылған күшейтулер шектеуші эндонуклеазалармен өңделді: S-NheI/XhoI кДНҚ гені үшін; N – NheI / SalI кДНҚ гені үшін; M-NdeI/XhoI кДНҚ гені үшін; Е – NdeI / SalI кДНҚ гені үшін. Рестрикциядан кейін тазартылған күшейтулер NdeI / SalI шектеу сайттары немесе NheI/SalI бойынша pET23c векторлық плазмидасына байланған. Лигаза қоспасымен E. coli DH5 штаммының жасушалары өзгерді. Өскен ДНҚ клондарынан хлороформды қолдану арқылы плазмидалар түзіліп, оқшауланған. ДНҚ клондары xbai/ Bpu1102I шектеу эндонуклеазаларын қолдана отырып, шектеу талдауы арқылы сыналды. сондай-ақ, генге тән праймерлерді қолдана отырып, ПТР талдауы арқылы кірістірулердің болуын растау жүргізілді. Клондалған нуклеотидтер тізбегін тексеру үшін pET23c_SARS-CoV2-S, pET23c_SARS-CoV2-N, pET23c_SARS-CoV2-М, pET23c_SARS-CoV2-E плазмидаларының бөлік секвенирлеуі (тек ДНҚ-ның клондалған бөлігі) жүргізілді.

– SARS-CoV-2 құрылымдық ақуыздарының ЕАР-ін күшейту үшін назофаренгальды жуудан алынған РНҚ препараты үлгі ретінде пайдаланылды, ол үшін бұрын S (B. 1.1) сызығының вирустық геномының бүкіл құрылымдық аймағы Сэнгер бойынша ДНҚ секвенирлеу әдісімен оқылды. Жоғары дәлдіктегі Phusion полимеразасын және құрамында клондау үшін шектеу орындары бар арнайы праймерлерді пайдалана отырып, S, M, N және E SARS-COV-2 құрылымдық ақуыздарының ЕАР алынды. Масақ протеині жағдайында S ақуыздың ЕАР ұзындығы толық емес, сигналдық пептидті, трансмембраналық және цитозолдық масақ протеинінің сегменттерін кодтайтын аймақтары амплифицирленген.

– Тиісті мөлшердегі күшейтулер алынды (3626 ж.н. – кДНҚ-ген S үшін; 1283 ж.н. – кДНҚ -ген N үшін; 694 ж.н. – кДНҚ -ген М үшін; 252 ж.н. – Е генінің кДНҚ үшін). Оларды тазартқаннан және тиісті шектеуші эндонуклеазалармен өңдегеннен кейін күшейтулер pET23c экспрессиялық векторына клондалды, бұл оған клондалған кДНҚ аймақтарын бактерия жасушаларында экспрессиялауға мүмкіндік берді. Клондау гистидинді кодтайтын алты триплет 3’ұшынан бастап олардың бір жақтауына қосылатын етіп жүзеге асырылды. Vector Nti бағдарламасында pET23c_SARS-CoV2-s, pET23c_SARS-CoV2-N, pET23c_SARS-CoV2-m, pET23c_SARS-CoV2-E плазмидаларының карталары салынған.

– Реттелген плазмидалар Midi-prep мөлшерінде жинақталған және GeneJET Plasmid Midiprep жинағымен (Thermo Fisher Sci.).

– E. coli BL-21(DE3) экспрессиялық штаммы жасушаларының трансформациясынан кейін ДНҚ құрылымдары мақсатты ақуыздардың ЕАР экспрессиясын жүргізді. pET23c_SARS-CoV2-N плазмидасын тасымалдайтын жасушалар 30 ºС-тан жоғары температурада іс жүзінде өспеді. IPTG қосқанға дейін оларды 28 ºС температурада, Lac-оперон активаторын қосқаннан кейін – 25 ºС температурада өсіру туралы шешім қабылданды. pET23C_SARS-CoV2-E және pET23c_SARS-CoV2-m плазмидаларымен түрлендірілген бактериялардың жасушалары IPTG қосылғанға дейін қалыпты түрде өсті, бірақ оны қоректік ортаға қосқаннан кейін жасушалық суспензиялардың оптикалық тығыздығы уақыт өте келе жоғарылаған жоқ, бұл оларда синтезделген вирустық ақуыздардың бактерияларына уыттылығын көрсетті. M-6His және E-6his ақуыздарының дамуы үшін cDNA экспрессия жағдайларын оңтайландыру кезінде IPTG концентрациясын 0,5 мМ-ден 0,1 мМ-ге дейін төмендету және cDNA экспрессиясының индукция уақытын төрт сағаттан бір сағатқа дейін қысқарту туралы шешім қабылданды. pET23C_SARS-CoV2-s плазмидасымен түрлендірілген жасушалар 30 ºС-тан жоғары температурада стандартты өсуді көрсетті, S кднқ генінің экспрессиясында проблемалар тіркелген жоқ.

– Бактерия жасушаларында рекомбинантты ақуыздар жасалғаннан кейін олардың еритін түрге өту қабілеті тексерілді. Тек рекомбинантты N-6His протеині супернатантта бактериялар лизисінен және 20000 г лизатты центрифугалаудан кейін 20 минут ішінде анықталды.

– S-6His, M-6His және E-6His ақуыздары тұнбада үнемі локализацияланған (яғни ерімейтін қосылатын денелер түзген немесе мембраналармен байланысқан) және іс жүзінде супранадентті сұйықтықта мүлдем болмаған (деректер ұсынылмаған). Жуғыш заттардың лизингтік ерітіндісіне қосу (1% Tween-20, 1% Triton X-100 немесе 1% SDS) мәселені шешпеді: S-6His-тің кейбір үлесі еритін фракцияға айналды, бірақ сонымен бірге димерлер мен басқа агрегаттар пайда болды (деректер ұсынылмаған). M-6His және E-6his ақуыздары жағдайында лизинг ерітіндісіне жуғыш заттарды қосу олардың еруіне әсер етпеді.

– S-6His, M-6His және E-6His ақуыздары денатурация жағдайында Ni-NTA агарозасы арқылы, ал N – 6His ақуызы аффиндік хроматография әдісімен табиғи жағдайда тазартылды. Элюцияланған Ni-NTA агарозалары ақуыздар құрамындағы имидазолдан немесе денатурациялаушы агенттерден құтылу және олардың рН-7 7,5-ке дейін реттеу үшін диализбен тазартылды. Диализден кейін белоктар шоғырланды. Синтезделген ақуыздарды талдау Вестерн-блоттинг әдісімен жүргізілді. 12,5% ПАА-гелі бар ақуыздар жартылай құрғақ дақ әдісімен нитроцеллюлоза мембранасына ауыстырылды. Таңбаланған ақуыздардың His-tag детекциясы 5-His тізбегіне моноклоналды антиденелер (алғашқы антиденелер) көмегімен жүргізілді, белоктарды бояу химилюминисцентті субстрат көмегімен жүргізілді.

-Барлық төрт SARS-CoV-2 ақуызы (N, S, E және M) синтезделді және тазартылды. Бұл ақуыздардың тазалық дәрежесі элюаттардағы барлық ақуыздардың 10-25% аралығында болды. Толық жинақталған және тазартылған ақуыздардың жалпы мөлшері (50 мл бастапқы жасушалық суспензиядан): 296,2 мкг (S ақуызы), 277,8 мкг (N ақуызы), 137,6 мкг (m ақуызы), 128,2 мкг (e ақуызы).

Жоба бойынша жарияланымдар

1. Zhigailov A.V., Maltseva E.R., Perfilyeva Y.V., Ostapchuk Y.O., Naizabayeva D.A., Berdygulova Zh.A., Kuatbekova S.A., Nizkorodova A.S., Mashzhan A., Gavrilov A.E., Abayev A.Zh., Akhmetollayev I.A., Mamadaliyev S.M., Skiba Y.A. Prevalence and genetic diversity of coronaviruses, astroviruses and paramyxoviruses in wild birds in southeastern Kazakhstan // Heliyon. 2022. –P. e11324. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e11324  (Scopus – 82%; Web of Science – Q1; Impact Factor-3.92).
2. Жигайлов А.В., Остапчук Е.О., Перфильева Ю.В., Абдолла Н., Мальцева Э.Р., Бердыгулова Ж.А., Найзабаева Д.А., Куатбекова С., Низкородова А.С., Бисенбай А.О., Черушева А.С., Исмагулова Г.А., Дмитровский А.М., Скиба Ю.А., Мамадалиев С.М. Клонирование открытых рамок считывания SARS-CoV-2, их экспрессия в клетках Escherichia coli и выделение рекомбинантных белков SARS-S-6His, SARS-S1-6His, SARS-N-6His, SARS-M-6His и SARS-E-6His // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2023. – №1, Т.94. – С. 90-100. https://doi.org/10.26577/eb.2023.v94.i1.08 (Журнал рекомендован КОКСОН МНВО РК; импакт-фактор 0,016 за 2019 г. по КазБЦ).
3. Perfilyeva Y.V., Maukayeva S.B., Smail Y.M., Dmitrovskiy A.M., Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Nizkorodova A.S., Berdygulova Zh.A., Naizabayeva D.A., Perfilyeva A.V., Maltseva E.R., Kamytbekova K.Zh., Skiba Y.A. Lethal pulmonary embolism in a pregnant woman with SARS-CoV-2 receiving prophylactic anticoagulation: A case report // Journal of Medical Case Reports. 2023. Статья принята в печать. (Scopus – 45%; Web of Science – Q3; Impact Factor – 0.289).