AP09259103 Выявление геномных и субгеномных характеристик циркулирующих в РК штаммов SARS-CoV-2 для разработки научно-обоснованных подходов к диагностике COVID-19

В рамках проекта планируется проведение генетической характеризацииметодом секвенирования вариантовSARS-CoV-2,вызвавших тяжелые последствия у пациентов из Казахстана. Будет исследовано изменение распространенности важных однонуклеотидных полиморфизмоввируса в популяции казахстанцев по мере развития эпидемии.Будет проведен скрининг субгеномных РНК вируса на различных этапах развития болезни нескольких пациентов. Также в рамках проекта будут клонированы открытые рамки считывания полипептидов SARS-CoV-2, являющихся наиболее перспективными мишенями для целей диагностики и разработки вакцин. Клонированные кДНК будут экспрессированы в бактериях, а синтезированные рекомбинантные белки – выделены и очищены. Полученные результаты послужат базой для создания отечественных тест-систем на основе ПЦР и ИФА, предназначенных для диагностики, типирования и прогностикиCOVID-19.

Актуальность

Вариабельность генома SARS-CoV-2 может в скором времени негативно сказаться на эффективности разрабатываемых к этому вирусу вакцин и средств диагностики. Поэтому необходимо постоянно отслеживать, какие генетические варианты вируса циркулируют в различных популяциях людей, чтобы поддерживать систему контроля заболевания на высоком уровне.Существует несколько подходов для оценки генетической вариабельности геномов вирусов.

Первый подход основан на считывании всего вирусного генома и дальнейшем анализеполногеномных библиотек. Данный подход позволяет быстро выявить наиболее часто встречаемые полиморфизмы. Полногеномное секвенирование – высоко затратный и сложный метод анализа; в последнее время он обычно проводится на секвенаторах нового поколения (NGS) [19, 21].

Второй подход предусматривает частичное секвенирование наиболее важных участков вирусного генома. Этот подход позволяет существенно сэкономить ресурсы и сосредоточиться только на наиболее информативных участках генома. Исследователи изменчивости SARS-CoV-2 в качестве главной мишени обычно выбирают ген белка S (являющийся высоко вариабельным): именно на S-белок SARS-CoV-2 вырабатывается больше всего вируснейтрализующих антител [23, 24], азамены в главном поверхностном белке коронавирусов могут повлиять на его связывание антителами. Важно, что на основе белкаS и его отдельных участков разрабатывается больше всего кандидатныхсубъединичных и векторных рекомбинантных вакцин [22]. Помимо белка Sиммунодоминантнымиу сарбековирусовявляются структурные белки M и N: эти три белка содержат наибольшее число эпитопов для презентации MHCI и MHCII [25-26]. Нуклеокапсидный белок Nявляется наиболее иммунодоминантным и наиболее консервативным из трех этих белков. К тому же, он не подвержен гликозилированию. Эти его характеристики делают его удобной мишенью для создания тест-наборов на основе ИФА для детекции SARS-CoV-2. Часто именно ген белка N выбирается в качестве мишени для детекции РНК SARS-CoV-2посредством ПЦР [27-29] из-за его консервативности и наивысшей копийности в сравнении с другими коронавирусными генами (вследствие 3′-концевой дислокации N-гена в гРНК, он присутствует и во всех сгРНК вируса) [30].

Третий подход генетической характеризации геномов SARS-CoV-2 подразумевает выявление в популяции людей конкретных, уже установленных полиморфизмов (чаще однонуклеотидных, SNP) с использованием быстрых, удобных для анализа методов на основе ПЦР или гибридизации нуклеиновых кислот.

В настоящем проекте планируется использовать все три вышеуказанных подхода для генетической характеризации генотипов SARS-CoV-2, циркулирующих на территории Казахстана. Полногеномное секвенирование для ограниченного количества образцов планируется выполнить с использованием платформы MinION (OxfordNanoporeTechnologies). Частичное (таргетное) секвенирование методом Сэнгера планируется провести для образцов, выделенных у пациентов с наиболее тяжёлыми клиническими проявлениями, включая смертельные исходы. Точечные SNP (такие как 241C/T и 23403A/G) будут определяться на большом количестве ПЦР-положительных образцов. Новизна исследования заключается, прежде всего, в том, что будут анализироваться образцы, полученные от казахстанцев.

В рамках предлагаемого проекта планируется анализировать не только генетические, но и субгенетические характеристики коронавируса. Поскольку активная репликация вируса и наработка сгРНК коронавирусов наблюдается в основном на стадии виремии, было высказано предположение, что сгРНКSARS-CoV-2 можно использовать в качестве маркера, позволяющего установить стадию коронавирусной инфекции [31]. Во время вспышек COVID-19 стационары зачастую переполнены, а остаточные количества РНК коронавируса могут долго оставаться в организме человека и давать положительный ответ по ПЦР, даже если в организме пациента активноначинает функционировать специфический Т- и В-клеточный иммунный ответ и размножение вирусапрекращается, что минимизирует шанс заражать других людей. Поэтому этот тип биомаркеров мог бы оказать неоценимую помощь медицинским работникам, занятым в контроле новой инфекции для дифференциации особо инфекционных пациентов от выздоравливающих людей с низким инфекционным потенциалом. В то же время, есть указания на то, что сгРНК нового коронавируса могут быть ассоциированы с клеточной мембраной клеток, что делает их более стабильными, чем считалось ранее [32]. В рамках проекта планируется проверить обоснованность использования в качестве биомаркера для определения стадии коронавирусной инфекции различные субгеномные РНК, чтобы определить целесообразность разработки отечественной тест-системы по выявлению сгРНК SARS-CoV-2. В ходе данного исследования также планируется использовать праймеры и пробы собственной разработки, при этом детектировать не одну, а несколько различных сгРНК.  Проведенные в рамках проекта исследования станут фундаментом для разработки различных отечественных тест-систем на основе ПЦР и ИФА для детекции и(или) прогностики COVID-19.

Цель

Провести популяционные исследования в отношении генотипов SARS-CoV-2, циркулировавших в Казахстане во время пандемии 2020 г.,анализ их субгеномных характеристик и получить рекомбинантные белки SARS-CoV-2 для выработки научно-обоснованных подходов к диагностике COVID-19.

Ожидаемые результаты

В ходе реализации проекта будут получены следующие прямые научные результаты:

  • ДНК-конструкции, содержащие фрагменты геномов отечественных генотипов SARS-CoV-2;
  • линии экспрессионных штаммов E. coli, экспрессирующие целевые кДНК-гены SARS-CoV-2;
  • очищенные рекомбинантные белки SARS-CoV-2;
  • новые праймеры и флуоресцентно меченые зонды для типирования SARS-CoV-2 и детекции его субгеномных РНК.

Полученные в ходе реализации проекта результаты позволят определить, какие отечественные тест-системы стоит разрабатывать для повышения эффективности диагностики и прогностики COVID-19. Будут получены данные о генотипах нового коронавируса, циркулирующих на различных этапах развития эпидемии в Казахстане. Разработанные в ходе реализации проекта праймеры и пробы, а также генетические конструкции, несущие участки вирусного генома могут быть использованы для разработки отечественных тест-систем на основе RT-qPCR для детекции и типирования SARS-CoV-2, а также прогнозирования тяжести заболевания. Выделенные рекомбинантные белки могут быть использованы для разработки отечественной тест-системы на основе ИФА для выявления антител к SARS-CoV-2.

Руководитель проекта

Скиба Ю.А., Руководитель проекта, кандидат биологических наук (молекулярная биология). Индекс Хирша: 6. ORCID: http://orcid.org/0000-0003-4895-1473. Scopus ID: 56677594900. WoSID: H-6528-2017.

Члены исследовательской группы

Низкородова А.С., кандидат биологических наук (молекулярная биология). Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1597-7207. Scopus ID: 57215971184. WoSID: AAY-1646-2020.

Дмитровский А.М., доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, врач-инфекционист. Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4714-3079. ScopusID: 57204864464. WoSID: AAZ-2816-2020.

Исмагулова Г.А.  – кандидат биологических наук (молекулярная биология). Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2735-4939. ScopusID: 6506396016. WoSID: AAO-3437-2020.

Бердыгулова Ж.А., PhD-докторант (биотехнология), специалист в области вирусологии и молекулярной биологии. Индекс Хирша: 4. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0379-2472. Scopus ID: 23977664200. WoS ID: I-2943-2018.

Неупокоева А.С., магистр биотехнологии.  Индекс Хирша: 1. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7257-8037. ScopusID: 57217703182. WoSID: N-9341-2017.

Березовский Д.В., магистр (медицина), врач гигиенист-эпидемиолог. Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2830-1994. ScopusID: 57212528777.  WoSID: AAY-6245-2020.

Найзабаева Д.А., магистр биотехнологии.ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0606-4289. Scopus ID: 57218288692.WoS ID: AAY-5696-2020.

Публикации и охранные документы по теме проекта

  1. SkibaY.; MokrousovI.; NabirovaD.; Ismagulova G.,et al. Mycobacterium tuberculosis RD-Rio Strain in Kazakhstan. Emerg. Infect. Dis. 2019;25(3):604-606. https://doi.org/10.3201/eid2503.181179. IF 6.259; Q1; Cite score 8.8; SJR 2.72; percentile 94. 
  2. Perfilyeva Y.V., ShapiyevaZ.Zh., Ostapchuk Y.O., Berdygulova Z.A., Bissenbay A.O., Kulemin M.V., Ismagulova G.A., Maltseva E.R., Skiba Y.A.,Sayakova Z.Z., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Tick-borne pathogens and their vectors in Kazakhstan – a review. Ticks and Tick-borne diseases. 2020;11(5):101498. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101498.IF 2.749; Q2; Cite score 5.2; SJR 1.182; percentile 95. 
  3. Ismagul A., Yang N., Maltseva E.,Skiba Y., et al. A biolistic method for high-throughput production of transgenic wheat plants with single gene insertions. BMC Plant Biology. 2018;18:135. https://doi.org/10.1186/s12870-018-1326-1. IF 3.497; Q1; Cite score 5.0; SJR 1.485; percentile 87. 
  4. Mokrousov I.,Chernyaeva E.,Vyazovaya A.,Skiba Y., et al. Rapid Assay for Detection of the Epidemiologically Important Central Asian/Russian Strain of the Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype. J Clin Microbiol. 2018;56(2):e01551-17. https://doi.org/10.1128/JCM.01551-17. IF 5.897; Q1;Cite score 8.6; SJR 2.601; percentile 91. 
  5. Mokrousov I., Shitikov E., Skiba Y. et al. Emerging peak on the phylogeographic landscape of Mycobacterium tuberculosis in West Asia: Definitely smoke, likely fire. Mol PhylogenetEvol. 2017;116:202-212. doi: 10.1016/j.ympev.2017.09.002. IF 3.496; Q2; Cite score 7.1; SJR 1.645; percentile 93. 
  6. Mokrousov I, Vyazovaya A, Iwamoto T, Skiba Y et al. Latin-American-Mediterranean lineage of Mycobacterium tuberculosis: Human traces across pathogen’s phylogeography. Mol PhylogenetEvol. 2016,99:133-143. doi: 10.1016/j.ympev.2016.03.020. IF 3.496; Q2;Cite score 7.1; SJR 1.645; percentile 93.
  7. Skiba Y.,Mokrousov I., Ismagulova G.,Maltseva E., et al. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: A country-wide study. Tuberculosis. 2015;95(5): 538-546. https://doi.org/10.1016/j.tube.2015.04.012. IF 2.576; Q3;Cite score 4.5; SJR 1.026; percentile 68.
  8. Султанов А.А., Егорова Н.Н., Скиба Ю.А., Даугалиева А.Т. Инновационный патент РК № 30443 «Способ определения микроорганизмов рода Salmonella». 15.10.2015. Бюл.№10.
  9. Abdiyeva K., Turebekov N., Dmitrovsky A., et al. Seroepidemiological and molecular investigations of infections with Crimean–Congo haemorrhagic fever virus in Kazakhstan. Int.J.Inf.Dis. 2019;78:121-127. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2018.10.015. IF 3.202; Q2.
  10. Turebekov N., Abdiyeva K., Yegemberdiyeva  R., Dmitrovsky A., et al. Prevalence of Rickettsia species in ticks including identification of unknown species in two regions in Kazakhstan. Parasites and Vectors. 2019;12:197. https://doi.org/10.1186/s13071-019-3440-9.IF 2.824; Q1.
  11. Head J.R., Bumburidi Y., Mirzabekova G., Berezovskiy D., et al. Risk Factors for and Seroprevalence of Tickborne Zoonotic Diseases among Livestock Owners, Kazakhstan. Emerg Infect Dis. 2020;26(1):70-80.https://dx.doi.org/10.3201/eid2601. IF 6.259; Q1.
  12. Kiseleva I.V., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Larionova N.V., Dubrovina I.A., Berdygulova Z.A., et al. Genome Composition Analysis of Reassortant Influenza Viruses Used in Seasonal and Pandemic Live Attenuated Influenza Vaccine. 2011;26(4):174-185. IF 0.25; Q4.
  13. Berdygulova Z., Esyunina D., Miropolskaya N., et al. A novel phage-encoded transcription antiterminator acts by suppressing bacterial RNA polymerase pausing. Nucleic Acids Research. 2012;40(9):4052-4063.https://doi.org/10.1093/nar/gkr1285. IF 11.501; Q1.
  14. Berdygulova Z., Westblade L.F., Florens L., et al. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus bacteriophage. J.Mol.Biol. 2011;405(1):125-142. IF 4.76; Q1.
  15. Minakhin L., Goel M., Berdygulova Z., et al. Genome Comparison and Proteomic Characterization of Thermus thermophilus Bacteriophages P23-45 and P74-26: Siphoviruses with Triplex-forming Sequences and the Longest Known Tails. J.Mol.Biol. 2008;378(2):468-480. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.02.018. IF 4.76; Q1.
  16. Zhigailov A.V. Alexandrova A.M., Nizkorodova A.S., et al. Evidence that phosphorylation of the alpha-subunit of eIF2 does not essentially inhibit mRNA translation in wheat germ cell-free system. Frontiers in Plant Science. 2020;11:936. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00936. IF 4.402; Q1.
  17. Nizkorodova A., Suvorova M., Zhigailov A., Iskakov B. The effect of translation promoting site (TPS) on protein expression in E. coli cells. Mol.Biotechnol. 2020.62(6-7):1-9. .https://doi.org/10.1007/s12033-020-00251-1.IF 2.022; Q3.
  18. Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Perfilyeva Y.V., Shumilina A.G., Yeraliyeva L.T., Nizkorodova A.S., Kuznetsova T.V., Iskakova F.A., Berdygulova Z.A., Neupokoyeva A.S., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Two case reports of neuroinvasive West Nile Virus infection in the Almaty region, Kazakhstan. IDCases. 2020;21:e00872. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2020.e00872. SJR 0.294.

Достигнутые результаты

2021 год

Было проведено частичное секвенирование генома SARS-CoV-2 с РНК, выделенных из образцов казахстанцев с тяжелой формой течения болезни, образцов из патологического материала.

Были разработаны праймеры на основе анализа нуклеотидных последовательностей ОРС гена S SARS-CoV-2 в программе MEGA-X и анализа вторичной структуры праймеров и дуплексов в программе RNA-structure; праймеры синтезированы и очищены в лаборатории органического синтеза РГП «НЦБ» КН МОН РК. Были получены уникальные длинные амплификаты, включающие всю ОРС спайкового белка SARS-CoV-2, для единичных ОТ ПЦР положительных образцов РНК, а также удалось получить два амплификата, полностью перекрывающих данную ОРС при использовании пары праймеров CoV-Lead-F/RvS и пары праймеров FwS/Sfull_Kpn_R. После очистки амплификатов проводили реакцию секвенирования по Сэнгеру с использованием синтезированных праймеров.

Было проведено секвенирование образцов от пациентов с тяжелой формой течения болезни, образцов из патологического материала, образцов от переболевших COVID-19 и повторно заразившихся новой коронавирусной инфекцией людей со среднетяжелым течением болезни, а также от провакцинировавшихся людей, которые заразились COVID 19 и проявляли выраженные болезненные симптомы. Для двенадцати РНК-положительных образцов удалось перекрыть ридами полную последовательность ОРС поверхностного гликопротеина (спайкового белка S). Во всех одиннадцати вариантах была выявлена мутация 23403A > G (приводящая к аминокислотной замене D614G в S-белке). В одном образце помимо замены 23403A > G в положении 23208 детектировался микс из нуклеотидов А/С. Нуклеотидная последовательность ОРС S белка семи образцов больше ничем не отличалась от исходной последовательности «уханьского» генетического варианта. Последовательности трех образцов содержали все замены, характерные для британского штамма альфа (по классификации ВОЗ) SARS-CoV-2 (S: HV69-70del; S: Y144del; S: N501Y; S: A570D S: D614G; S: P681H; S: T716I; S: S982A; S: D1118H). Один из образцов содержал все эти мутации (характерные для альфа-штамма вируса по классификации ВОЗ) кроме замены S:T716I. Последовательности этих двенадцати ОРС спайкового белка выложены в базу GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank): номера GenBank c OK354348 по OK354359.

2022 год

Проведен скрининг ПЦР-положительных образцов, отобранных на различных этапах развития эпидемии COVID-19 в Казахстане, по выявлению наиболее важных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) SARS-CoV-2.

— Проведен дизайн праймеров и проб для выявления наиболее важных мутаций SARS-CoV-2 методом классической ОТ-ПЦР (выявление SNP, делеций и инсерций) и RT-qPCR (SNP). Проведен их синтез de novo и очистка методом ВЭЖХ.

— За период с 01 апреля 2020 г. по 30 апреля 2022 г. проведен отбор ОТ-ПЦР-положительных тотальных препаратов РНК по COVID-19, полученных от пациентов.

— Методом RT-qPCR проведен скрининг первой важной мутации в участке гена S, кодирующего фурин-распознающем участке спайкого белка SARS-CoV-2.

— Методом классической ОТ-ПЦР проведен скрининг мутаций для дифференциации вариантов VOCs друг от друга и от вариантов, не отнесенных к VOC.

Разработаны, синтезированы и очищены праймеры и зонды для выявления наиболее важных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) SARS-CoV-2 методом ПЦР.

— Нуклеотидные последовательности генетических вариантов, которые были утверждены ВОЗ в качестве нотифицируемых (VOCs), а именно – альфа (B.1.1.7), бета (B1.351), гамма (B.1.1.248), дельта (B.1.617+) и омикрон (B.1.1.529).

— Разработаны, синтезированы и очищены праймеры для выявления наиболее важных мутаций (SNP, делеций и инсерций), позволяющих дифференцировать все пять генетических вариантов VOCs SARS-CoV-2 методом классической ПЦР.

— Подобраны, синтезированы и очищены праймеры и зонд для выявления мутации “23403A > G” (S: D614G) методом RT-qPCR (ПЦР в реальном времени).

Проведено ПЦР-типирование вирусных РНК, выделенных из образцов, поступивших на различных этапах развития эпидемии в Казахстане.

— На пятидесяти ОТ-ПЦР положительных образах на начальной стадии пандемии (апрель-сентябрь 2020 год) проведен анализ по выявлению мутации 23403A > G” (S: D614G). Выявлен лишь один образец (из самых ранних), не содержащий мутацию.

— На различных этапах развития пандемии COVID-19 составлена репрезентативная выборка образцов (от двух ста пациентов), давших положительный ответ по RT-qPCR с наименьшим значением Ct.

— Проведено типирование 200 ПЦР-положительных образов в отношении принадлежности или непринадлежности к тому или иному VOC SARS-CoV-2. Варианта гамма (B.1.1.248) не выявлено. Выявлен лишь один вариант бета (B1.351). Выявлено 37 образцов варианта альфа (B.1.1.7), 25 образцов варианта дельта (B.1.617+) и 39 образцов варианта омикрон (B.1.1.529).

— Создана электронная база по генетическим вариантам SARS-CoV-2.

2023 год

На основе литературных данных были выбраны полипептиды SARS-CoV-2, являющиеся наиболее перспективными мишенями для диагностики и разработки вакцин: спайк-белок S, мембранный белок М, нуклеопротеин N, структурный белок E. В программе Vector NTI 11.0 проведен анализ нуклеотидных последовательностей участков вирусного генома, кодирующих эти структурные белки коронавируса для основных нотифицируемых генетических вариантов (альфа, бета, гамма, дельта, омикрон) и исходного генетического варианта. Выбраны участки с наименьшими генетическими различиями между основными генетическими вариантами SARS-CoV-2, также все нуклеотидные последовательности проанализированы на наличие тех или иных сайтов рестрикции. Разработаны праймеры для клонирования упомянутых выше ОРС SARS-CoV-2, содержание соответствующие сайты рестрикции для клонирования амплификатов в экспрессионный вектор E. coli pET23c. Все праймеры синтезированы и очищены.

— С целью наработки потенциальных мишеней для ИФА-наборов были клонированы ОРС спайкового поверхностного гликопротеида S, мембранного белка М, нуклеопротеина N и белка порина Е. Для клонирования ОРС белка S использовалась только кДНК, кодирующая участок белка S с экстрамембранной локализацией. Проведена ПЦР с использованием высокоточного фермента. Очищенные амплификаты обрабатывали рестрицирующими эндонуклеазами: для кДНК-гена S – NheI/XhoI; для кДНК-гена N – NheI / SalI; для кДНК-гена M – NdeI/XhoI; для кДНК-гена Е – NdeI / SalI. Очищенные после рестрикции амплификаты лигировали в векторную плазмиду pET23c по сайтам рестрикции NdeI / SalI, либо по NheI/SalI. Лигазной сместью трансформировали компетентные клетки штамма E.coli DH5. Из выросших ДНК-клонов наработаны и выделены плазмиды методом с использованием хлороформа. ДНК-клоны тестировали методом рестрикционного анализа с использованием рестрицирующих эндонуклеаз XbaI/ Bpu1102I. Также проведено подтверждение наличия вставок методом ПЦР-анализа с использованием гено-специфических праймеров. Для верификации клонированных нуклеотидных последовательностей, проведено частичное секвенирование (только клонированного участка ДНК) плазмид pET23c_SARS-CoV2-S, pET23c_SARS-CoV2-N, pET23c_SARS-CoV2-M, pET23c_SARS-CoV2-E.

— Для амплификации ОРС структурных белков SARS-CoV-2 в качестве матрицы использовался препарат РНК из назофаренгального смыва, для которого прежде методом секвенирования ДНК по Сэнгеру была считана вся структурная область вирусного генома линии S (B.1.1). С использованием высокоточной полимеразы Phusion и специфических праймеров, содержащих сайты рестрикции для клонирования, были получены амплификаты ОРС структурных белков S, M, N и E SARS-CoV-2. В случае спайкового белка S амплифицировали не полнодлинную ОРС этого белка, а усеченную ее область без участков, кодирующих сигнальный пептид, трансмембранный и цитозольный сегменты спайкового белка.

— Получены амплификаты соответствующих размеров (3626 п.о. – для кДНК-гена S; 1283 п.о. – для кДНК-гена N; 694 п.о. – для кДНК-гена М; 252 п.о. – для кДНК гена Е). Амплификаты после их очистки и обработки соответствующими рестрицирующими эндонуклеазами были клонированы в экспрессионный вектор pET23c, позволяющий экспрессировать клонированные в него участки кДНК в клетках бактерий. Клонирование осуществлялось таким образом, чтобы к целевым ОРС с 3′-конца в одной с ними рамке прибавлялись шесть триплетов, кодирующих гистидин. В программе Vector NTI построены карты плазмид pET23c_SARS-CoV2-S, pET23c_SARS-CoV2-N, pET23c_SARS-CoV2-M, pET23c_SARS-CoV2-E. С Т7-промотора проведено секвенирование клонированных участков ДНК по Сэнгеру.

Секвенированные плазмиды наработаны в количествах midi-prep и выделены набором GeneJET Plasmid Midiprep Kit (Thermo Fisher Sci.).

— Опубликована статья в журнале, входящем в КОКСОН: Жигайлов А.В., Остапчук Е.О., Перфильева Ю.В., Абдолла Н., Мальцева Э.Р., Бердыгулова Ж.А., Найзабаева Д.А., Куатбекова С., Низкородова А.С., Бисенбай А.О., Черушева А.С., Исмагулова Г.А., Дмитровский А.М., Скиба Ю.А., Мамадалиев С.М. Клонирование открытых рамок считывания SARS-CoV-2, их экспрессия в клетках Escherichia coli и выделение рекомбинантных белков SARS-S-6His, SARS-S1-6His, SARS-N-6His, SARS-M-6His и SARS-E-6His // Вестник КазНУ. Серия биологическая. — 2023. – №1, Т.94. – С. 90-100. https://doi.org/10.26577/eb.2023.v94.i1.08 (Импакт-фактор 0,016 за 2019 г. по КазБЦ, журнал рекомендован ККСОН МОН РК).