Жоба идеясы

CRISPR/Cas9 жүйесінің негізгі компоненттерін және осы компоненттерді ядролық геномға жеткізу әдістерін оңтайландыру, сонымен қатар картоптағы құрғақшылыққа төзімділік механизмдеріне жауап беретін гендерді мақсатты түрде өзгерту.

CRISPR/Cas9 көмегімен геномдық редакциялау генетика мен өсімдік шаруашылығындағы революциялық технология болып табылады. Бұл технология геномға нақты және мақсатты әсер етуді қамтамасыз етеді, уақыт шығындарын айтарлықтай азайтады және кездейсоқ өзгерістерге негізделген дәстүрлі мутагенез әдістерімен салыстырғанда берілген сипаттамалары бар сорттарды жасауға мүмкіндік береді. Бүгінгі күні CRISPR/Cas9 әмбебаптығы дәлелденді, бұл оның өсімдіктердің құрғақшылыққа төзімділігін зерттеуде және осы стресске төзімділігі жақсартылған жаңа сорттарды жасауда сәтті қолданылуын көрсетеді.

Өзектілігі

Жоба картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін талдау кезінде оңтайландырылған CRISPR/Cas9 элементтерінің Cas9 ерекшелігіне әсерін зерттейді.

Жобаны өсімдіктердің генетикалық инженериясы әдістерін, соның ішінде өсімдіктердің молекулалық биологиясы мен биотехнологиясы саласындағы мамандар жұмыс істейтін геномдық редакциялау әдістерін меңгерген топ жүзеге асырады.

Зерттеудің ғылыми жаңалығы оның элементтерін және CRISPR/Cas9 компоненттерін картоптың ядролық геномына жеткізу әдістерін оңтайландыру арқылы CRISPR/Cas9 технологиясының тиімділігін арттыру жоспарлануда. Картоптың жоғары өнімді отандық сорттары негізінде картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін зерттеуге баса назар аударылады. CRISPR/Cas9 жүйесінің элементтерін оңтайландыруға және компоненттерді ядролық геномға жеткізу әдістеріне негізделген картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін зерттейтін басқа жарияланған зерттеулердің жоқтығын атап өту маңызды.

Бұл жобаның негізгі маңыздылығы картоптың құрғақшылыққа төзімділігін реттейтін гендерді анықтауға бағытталған. Зерттеу нәтижелері төзімділіктің негізінде жатқан молекулалық механизмдерді тереңірек түсінуді қамтамасыз етіп қана қоймайды, сонымен қатар ауыл шаруашылығы дақылдарының құрғақшылыққа төзімділігін арттыру үшін геномды редакциялау технологияларын одан әрі жетілдіру үшін құнды ақпарат береді. Бұл деректер өсімдіктің жаңа сорттарын дамыту және тұрақты ауыл шаруашылығын қамтамасыз ету үшін кілт болуы мүмкін.

Жобаның мақсаты

Картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін зерттеу үшін CRISPR/Cas9 компоненттерін ядролық геномға жеткізу әдістері мен жүйенің элементтерін оңтайландыру арқылы CRISPR/Cas9 технологиясының тиімділігін арттыру.

Күтілетін нәтижелер

Жобаның негізгі күтілетін нәтижесі картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін зерттеу үшін CRISPR/Cas9 компоненттерін ядролық геномға жеткізу әдістері мен жүйелік элементтерін оңтайландыру арқылы CRISPR/Cas9 технологиясының тиімділігін арттыру болып табылады.

Жобаны орындау нәтижесінде

1. CRISPR/Cas9 жүйесінің элементтері картоптың құрғақшылыққа төзімділігімен байланысты мақсатты гендердің модификациясы үшін сәтті оңтайландырылатын болады.
2. Осы элементтерді жасушаларға тиімді жеткізу үшін гендік-инженерлік конструкциялар жасалады.
3. Картоптың ядролық геномына CRISPR/Cas9 компоненттерін жеткізудің әртүрлі әдістеріне талдау жүргізіледі. Геномды редакциялаудың жоғары тиімділігін қамтамасыз ететін таңдаулы әдіс анықталады.
4. Жүйенің оңтайландырылған элементтерін пайдалана отырып, картоптың ядролық геномына CRISPR/Cas9 компоненттерін жеткізудің инновациялық әдісі әзірленетін болады.
5. CRISPR/Cas9 жүйесінің оңтайландырылған элементтерін және құрғақшылыққа төзімділікті пайдалана отырып, геномды редакциялау деңгейін қоса алғанда, әзірленген жеткізу әдісін кешенді бағалау жүргізіледі.
6. Картоп геномындағы құрғақшылыққа төзімділікпен байланысты гендер мен механизмдерге талдау жасалады. Редакцияланған картоп өсімдіктерінің геномында антиоксиданттық қорғанысты қалыптастыруға жауапты РОТ, пролин, MDA, хлорофилл және ферменттер кешені деңгейлерін зерттеу деректері.
   Бұл нәтижелер картоптың төзімді сорттарын жасау және құрғақшылық жағдайында өнімділікті арттыру үшін маңызды. Олар CRISPR/Cas9 технологиясын қолдана отырып және ауыл шаруашылығы үшін геномды редакциялау саласында жаңа перспективалар ашады.
7. 7. Жобаның ғылыми бағыты бойынша Web of Science базасында 1 (бірінші), 2 (екінші) және (немесе) 3 (үшінші) квартилге кіретін және (немесе) Scopus базасында CiteScore бойынша кемінде 60 (алпыс) процентилі бар рецензияланатын ғылыми басылымдарда кемінде 3 (үш) мақала және (немесе) шолулар; немесе Web of Science базасында 1 (бірінші) және (немесе) 2 (екінші) квартилге кіретін және (немесе) Scopus базасында CiteScore бойынша кемінде 70 (жетпіс) процентилі бар рецензияланатын ғылыми басылымдарда кемінде 2 (екі) мақала және (немесе) шолулар; Journal Citation Reports базасында кемінде 90 (тоқсан) процентилі бар немесе Scopus базасында CiteScore бойынша процентилі кемінде 90 (тоқсан), сондай-ақ рецензияланатын шетелдік немесе ҒЖБССҚК ұсынған отандық басылымда кемінде 1 (бір) мақала немесе шолу жарияланатын болады.

Жоба жетекшісі

Манабаева Шуга Аскаровна. Хирша индексі 5. https://publons.com/researcher/2449535/shuga-a-manabayeva/; ResearcherID Web of Science: A-2529-2015 

Жоба тақырыбына қатысты ғылыми жетекші мен зерттеу тобы мүшелерінің жарияланымдары мен қорғау құжаттары:

1. Abeuova L., Kali B., Tussipkan D., Akhmetollayeva A., Ramankulov Y., Manabayeva Sh. CRISPR/Cas9-mediated multiple guide RNA-targeted mutagenesis in the potato // Transgenic Research (2023). https://doi.org/10.1007/s11248-023-00356-8
2. Tussipkan Dilnur and Manabayeva Shuga A. Employing CRISPR/Cas technology for the improvement of potato and other tuber crops // Frontiers in Plant Science. – 2021, V. 12, p.1-16. doi.org/10.3389/fenvs.2022.828257, IF= 5.753
3. Abeuova L.S., Kali B.R., Rakhimzhanova A.O., Bekkuzhina S.S., Manabayeva Sh.A.  High frequency direct shoot regeneration from Kazakh commercial potato cultivars // PeerJ. –2020. Vol. 2020, Issue 7, 2020, Article number e9447. doi.org/10.7717/peerj.9447 Web of Science Q2, Corresponding author
4. Ахметоллаева А.С., Манабаева Ш.А. Создание экспрессионного вектора для мультиплексного редактирования гена вакуолярной инвертазы картофеля системой CRISPR/CAS9 // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. – 2024. – № 3. – С. 43-55. https://doi.org/10.11134/btp.3.2024.5
5. Қали Б.Р., Рахимжанова А.О., Манабаева Ш.А. Отандық картоп сұрыптарының тікелей емес регенерациясы // Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің Хабаршысы / Биологиялық ғылымдар сериясы. – Нұр-Сұлтан, 2022. – №2(139). – С.61-69. https://doi.org/10.32523/2616-7034-2022-139-2-61-69.

Қол жеткізілген нәтижелер

2024 ж.

Тетраплоидты картоп геномындағы құрғақшылыққа төзімділікпен теріс корреляцияланған гендерді іздеу үшін түрлі дақылдар бойынша гомолог және ортолог гендер талданды. Құрғақшылыққа төзімді өсімдіктерді құруға арналған CRISPR/Cas9 технологиясының тиімділігі устьицаның жабылуын жақсартатын OST2 мутациялары бар Arabidopsis мысалында расталғаны анықталды. SRL1 және SRL2 гендерінің нокаутқа ұшырауы құрғақшылыққа төзімділікті арттыра отырып, жапырақтардың бұралуын тудырды. Қызанақтағы NPR1 транскрипциялық факторын талдау олардың устьицаны реттеудегі және құрғақшылыққа төзімділікпен байланысты гендердің экспрессиясындағы маңызды рөлін анықтады. Бидайдағы DREB2 және ERF3 факторларының CRISPR мутациялары және NAC071-A модификациясы құрғақшылыққа төзімділікті күшейтті, ал dCas9-HAT жүйесі күріш пен рапстың төзімділігін жоғарылатып, AREB1 экспрессиясын арттырды.

Біздің зерттеулерімізде CRISPR/Cas9 жүйесінің оңтайландырылған элементтерін және компоненттерін ядролық геномға жеткізудің жақсартылған әдістерін қолданып, картоптың құрғақшылыққа төзімділік механизмдерін зерттеу үшін транскрипциядан кейінгі деңгейде құрғақшылыққа төзімділікті теріс реттеуге қатысатын микроРНК827 (MIR827) таңдалды. MIR827 нуклеотидтер тізбегі NCBI халықаралық сайтынан (NR_127248.1) алынды және биоинформатикалық бағдарламалар https://crispr.dbcls.jp/ және http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/ арқылы талданды. MIR827-дегі NGG (PAM) тринуклеотидтері зерттелді және әрбір тринуклеотид үшін PAM 5′ немесе 3′ ұшындағы 20 нуклеотид құрамы талданды. Нәтижесінде бағыттаушы РНҚ-ның потенциалды өзгермелі бөліктері ретінде үш мақсатты тізбек таңдалды. Осы тізбектерді BbsI сайттары бойынша бағыттаушы РНҚ-ның тұрақты бөлігіне клондап, аралық векторлық конструкциялар алынды: р203mir1, р204mir2, р205mir3.

CRISPR/Cas9 көмегімен картоптың MIR827 редакциялау үшін екілік экспрессиялық векторы pMR284 (15,567 bp) таңдалды, оған аралық векторлық құрылымдар Gateway жүйесі арқылы клондалады. Әрі қарай, Cas9 ақуызын кодтайтын ген AscI рестрикция сайттарымен ядролық локализация сигналын қосу арқылы оңтайландырылды және РНҚ полимераза II PCUbi промоторының бақылауымен pMR284 екілік векторына клондалады. Нәтижесінде MIR827 мақсатты учаскелерін өзгертуге және CRISPR/Cas9 жүйесінің жұмысына, сондай-ақ картоптың құрғақшылыққа төзімділік тетіктерін кейінгі зерттеуге қажетті барлық элементтерден тұратын вектор жасалды.