Өзектілігі

Жаңа буын құралдарының, биологиялық үлгілерді талдаудың жаңа әдістерінің, сондай-ақ жетілдірілген бағдарламалық қамтамасыз ету құралдарының пайда болуы арқылы ақуыздарды анықтау мүмкіндіктерін айтарлықтай жақсартуға жағдай жасалды. Мысалы, HPP жаһандық бастамасы шеңберінде ақуызды сәйкестендіру саны 2011 жылы 13588-ден 2020 жылы 17874-ке дейін арттырылды, бұл адам протеомасының динамикалық диапазонының 7-ден астам ретін құрайды. Бұл жетістіктер өте маңызды, өйткені әртүрлі аурулардың биомаркерлері әдетте жасушада аз мөлшерде өндіріледі, оларды кейде дәстүрлі талдау әдістерімен анықтау қиын. Сонымен қатар, протеомиканың заманауи әдістері жасушаның жұмыс істеу механизмдерін тереңірек зерттеуге және түсінуге жаңа мүмкіндіктер ашады. Осылайша, «Ұлттық биотехнология орталығының» протеомдық платформасының аналитикалық мүмкіндіктерін кеңейту іргелі ғылымның да, қолданбалы ғылымның да, оның ішінде, бірінші кезекте медицина мен денсаулық сақтау мәселелерін де тиімдірек шешуге мүмкіндік береді.

Мақсаты

Ғылыми-зерттеу жобасының мақсаты деректерге тәуелсіз спектрлердің жинақталуын (DIA) және оларды ақуыздардың жасушаішілік таралуын терең талдау, пост-трансляциялық модификацияларын және ақуыз-ақуыздың өзара әрекеттесуін зерттеуге арнлған машиналық оқыту алгоритмдеріне негізделген бағдарламалар арқылы өңдеуді біріктіру негізінде жаңа жұмыс үрдісін қалыптастыру болып табылады.

Жобаның мақсатты DDA, MRM секілді дәстүрлі әдістермен қатар, DIA жаңа әдісін, және де алынған нәтижелерді өңдеуге арналған әртүрлі компьютерлік программаларды қолдану арқылы орындалады.

Жобаның модельдік міндеттері ақуыздардың жасушаішілік (ядро, органеллалар және цитоплазма) таралуын нақтылау, трансляциядан кейінгі модификацияларды (убиквитинирлену, сумоилирлену), ақуыз-ақуыздың өзара әрекеттесуін және олардың ДНҚ репарациясы ақуыздарының, ядро мембраналарының және транскрипциялық плюрипотенттік факторларымен логикалық байланысының мысалы ретінде терең зерттеу болып табылады. Аталған мәселелерді шешу үшін жасушаны фракциялаудың дәстүрлі және жаңа әдістері, сондай-ақ мутантты TurboID биотин лигазасы арқылы проксимальды биотинилдену және жақындаудан биотинилдену (Proximity Utilizing Biotinylation, PUB)  мысалында ақуыздарды ферментативті in vivo таңбалаудың жаңа әдістері қолданылады. Осы кезеңдердің өлшенетін орындалу көрсеткіштері DDA→Mascot, MRM→Skyline, DIA→ML / DL әр түрлі жұмыс процестерін қолданғаннан кейін алынған үлгілерді сапалы және сандық талдау нәтижелері болады.

Күтілетін нәтижелер

1. LC-MS/MS үшін үлгі дайындау хаттамаларымен үйлесімді HEK293T және CHO жасушаларының жасушаішілік фракциялау хаттамасы оңтайландырылады.
2. ML/DL бағдарламалары арқылы HEK293T және CHO жасушаларының субклеткалық фракцияларының ақуыздарын анықтау және сандық талдау нәтижелері алынады.
3. BirA-UBA-X, BirA-UIM-X (X=GFP, RAD18,  SOX2, OCT4, NANOG) гендік-инженерлік конструкциялары және HEK293T және CHO жасушаларында убиквитинирленген және сумоилирленген «серіктес» ақуыздардың биотинилдену нәтижелері алынады.
4. ML/DL бағдарламалары арқылы убиквитинирленген және сумоилирленген RAD18, POLH,  SOX2, OCT4, NANOG «серіктес» ақуыздарды анықтау және сандық талдау нәтижелері алынады.
5. TurboID-X (X=EMD, NRM, SOX2, OCT4, NANOG, RAD18, POLH) гендік-инженерлік конструкциялары құрылады және әзірленеді, HEK293T және CHO жасушаларында олардың «серіктес» ақуыздарының биотинилденуі бойынша нәтижелер алынады.
6. ML/DL бағдарламалары арқылы EMD, NRM, SOX2, OCT4, NANOG, RAD18, POLH «серіктес» ақуыздарын анықтау және сандық талдау нәтижелері алынады.

Жоба жетекшісі

Кулыясов Арман Табылович, жоба жетекшісі – химия ғылымдарының кандидаты, ҚР ҰБО протеомика және масс-спектрометрия зертханасының жетекші ғылыми қызметкері. Хирш индексі (h-index) – 10 (Scopus). Author ID: Scopus https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=7004152301; Researcher ID Web of Science https://www.webofscience.com/wos/author/record/K-9148-2017; ORCID ID https://orcid.org/0000-0002-7932-5689

Зерттеу тобының мүшелері

Ахметоллаев Ильяс Амирханович (h-index – 1), биология ғылымдарының кандидаты, жетекші ғылыми қызметкер, «Ұлттық биотехнология орталығы» ЖШС Органикалық синтез зертханасының меңгерушісі, молекулалық биология және олигонуклеотидтердің химиялық синтезі және оларды модификациялау саласындағы маман. Ғылыми жұмыс тәжірибесі 20 жыл. 5 мақаланың авторы. Ресейде олигонуклеотидтер синтезі бойынша тағылымдамадан өтті. Жобадағы қызметі – олигонуклеотидтердің химиялық синтезі және олардың модификациясы.

Манат Есбол (h-index – 1),PhD, «Ұлттық биотехнология орталығы» ЖШС бағаналы жасушалар зертханасының ғылыми қызметкері, Әл-Фараби ат. ҚазҰУ биология факультетінің түлегі, биотехнология мамандығы (2006-2010). Л. Н. Гумилева ат. Еуразия ұлттық университетінің жаратылыстану ғылымдары бойынша магистратура (2010-2012). Доктор Джесика Абботтың  жетекшілігімен Лунд университетінде (Швеция) PhD докторантурада тағылымдамадан өту және оқу (2016-2021). 2021 жылы PhD философия докторы ғылыми дәрежесін алу үшін диссертация қорғады. Сондай-ақ биоинформатика, атап айтқанда R бағдарламалау тілі және статистикалық деректерді өңдеу бойынша жұмыс тәжірибесі бар.

Махсатова Сая, биохимиялық инженерия мамандығы бойынша Дебрецен университетінің (Венгрия) бакалавры, 2019-2023жж.

Жоба тақырыбына қатысты ғылыми жетекші мен зерттеу тобы мүшелерінің жарияланымдары мен қорғау құжаттары

1. Shoaib M., Kulyyassov A., Robin C., Winczura K., Tarlykov P., Despas E., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to study chromatin in proximity to a protein of interest // Genome Research.-2013.-Vol.23, №2.-P.331-340. doi:10.1101/gr.134874.111 (Q1)
2. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K., Kulyyassov, A.T. and Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma GPR161 receptor.//Asia Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol.- 2019.-Vol. 27 (4) .-P. 85-95. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 (Q4)
3. Kulyyassov A., Ogryzko V. In Vivo Quantitative Estimation of DNA-Dependent Interaction of Sox2 and Oct4 Using BirA-Catalyzed Site-Specific Biotinylation // Biomolecules. ‒ 2020. ‒ Vol. 10, № 1. DOI: 10.3390/biom10010142 (Q1)
4. Adish Zh., Mukantayev K., Tursunov K., Ingirbay B., Kanayev D., Kulyyassov A., Tarlykov P., Mukanov K., Ramankulov Y. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor // Reports of Biochemistry and Molecular Biology. ‒ 2020. ‒ Vol.8, №4. ‒ P.347-357. http://rbmb.net/article-1-391-en.html (Q3)
5. Kulyyassov A., Fresnais M., Longuespee R. Targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of proteins: Basic principles, applications, and perspectives // Proteomics. ‒ 2021. ‒ Vol. 21, № 23-24, e2100153. – P.1-20. – doi: 10.1002/pmic.202100153, PMID: 34591362, IF3.984, Q2 (2020, WoS), percentile 73 on Biochemistry, CiteScore 6.3 (2020, Scopus);
6. Kulyyassov A. Application of Skyline for Analysis of Protein–Protein Interactions In Vivo // Molecules. ‒ 2021. ‒ Vol. 26, № 23, 7170, – P.1-11. – doi: 10.3390/molecules26237170, PMID: 34885753, IF4.412, Q2 (2020, WoS), percentile 74 on Chemistry, CiteScore 4.7 (2020, Scopus);
7. Kulyyassov A., Ramankulov Y., Ogryzko V. Generation of Peptides for Highly Efficient Proximity Utilizing Site-Specific Biotinylation in Cells // Life (Basel). ‒ 2022. ‒ Vol. 12, № 2, 300. ‒ P.1-14. – doi: 10.3390/life12020300, PMID: 35207587, IF3.817, Q2 (2020, WoS), percentile 50 on General Biochemistry, Genetics and Molecular Biology, CiteScore 2.6 (2020, Scopus);
8. Kanayev D., Abilmazhenova D., Akhmetollayev I., Sekenova A., Ogay V., Kulyyassov A. Detection of Recombinant Proteins SOX2 and OCT4 Interacting in HEK293T Cells Using Real-Time Quantitative PCR // Life (Basel). ‒ 2023. ‒ T. 13, № 1.-P1-10.-https://doi.org/10.3390/life13010107, PMID: 36676054, IF3.817, Q2 (2020, WoS), percentile 50 on General Biochemistry, Genetics and Molecular Biology, CiteScore 2.6 (2020, Scopus);
9. Кулыясов А.Т., Раманкулов Е.М., Огрызько В.В. Евразийский патент. Номер 034880. Номер заявки №201500724. Дата подачи 28.05.2015. Дата публикации и выдачи 01.04.2020. Применение биотин-лигазы BirA и пептидов-акцепторов биотина BAP1070 и BAP1108 для детектирования белок-белковых взаимодействий in vivo с использованием пар Bira/BAP1070 и Bira/BAP1108. https://www.eapo.org/ru/patents/reestr/patent.php?id=34880
10. Кулыясов А.Т., Огрызько В.В. Рекомбинантная плазмида pcDNA3.1(+)-BAP-HP1a, кодирующая гетерохроматиновый белок человека HP1a и обеспечивающая его экспрессию в клетках НЕК293Т. Патент Республики Казахстан на изобретение, регистрационный номер 2013/1352.1. Номер 30034, бюллетень №6, http://kazpatent.kz/images/bulleten/2015/gazette/pdf/2-201506.pdf
11. Кулыясов А.Т., Огрызько В.В. Рекомбинантная плазмида pcDNA3.1(+)-BAP-KAP1, кодирующая белок транскрипционного кофактора человека KAP1 и обеспечивающая его экспрессию в клетках НЕК293Т. Патент Республики Казахстан на изобретение, регистрационный номер 2013/1377.1. Номер 30035, бюллетень №6, http://kazpatent.kz/images/bulleten/2015/gazette/pdf/2-201506.pdf
12. Kulyyassov A., Shoaib M., Pichugin A., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-MS: A Mass Spectrometry-based Method to Monitor Protein-Protein Proximity in vivo //J. Proteome Res.-2011 .-Vol.10, No.10.-P.4416-4427. doi: 10.1021/pr200189p.
13. Kulyyassov A., Shoaib M., Ogryzko V. Use of in vivo biotinylation for chromatin immunoprecipitation // Curr. Protoc. Cell Biol.-2011.- Chapter 17, Unit17.12. doi: 10.1002/0471143030.cb1712s51.
14. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M., Ogryzko V.V. In vivo Biotinylation Based Method for the Study of Protein-Protein Proximity in Eukaryotic Cells// Cent Asian J Glob Health. – 2014 Cent Asian J Glob Health. – 2014 Jan 24;2(Suppl):96. doi: 10.5195/cajgh.2013.96. eCollection 2013.
15. Kulyyassov A., Zhubanova G, Ramanculov E, Ogryzko V. Proximity Utilizing Biotinylation of Nuclear Proteins in vivo. // Cent Asian J Glob Health. – 2015 Jun 15;3(Suppl):165. doi: 10.5195/cajgh.2014.165. eCollection 2014.
16. Issabekova A.S., Zhunusova M.S., Ramanculov E.M., Kulyyassov A.T. Comparison and optimization of transient transfection methods at HEK293T cell line. // Eurasian journal of applied biotechnology.-2017.- No.1.-P.38-43. DOI: 10.11134/btp.1.2017.5
17. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M., Ogryzko V.V. Cloning and expression of recombinant protein of SUMO, fused with biotin acceptor peptide // Eurasian journal of applied biotechnology. – 2018. -№1. – P.37-41. DOI: 10.11134/btp.1.2018.6
18. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M. Applications of the Impact II high resolution quadrupole time-of-flight (QTOF) instrument for shotgun proteomics // Eurasian journal of applied biotechnology. – 2018. -№3. – P.3-18. DOI: 10.11134/btp.3.2018.1
19. Yessimseitova A.K., Shustov A.V., Ahmetollaev I.A., Krassavin V.F., Kakimzhanova A.A. Molecular-genetic certification of potato varieties and forms using SSR-markers // Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2015, №2, pp. 4-16. DOI: 10.11134/btp.2.2015.6.

Қол жеткізілген нәтижелер

2023 ж.

Күнтізбелік жоспардың бірінші кезеңі шеңберінде HEK293T және CHO жасушаларының жасушаішілік фракциялану хаттамасын оңтайландыру жүргізілді.

Химиялық фракциялау әдістері центрифугалау немесе ультрацентрифугалау әдістерінен айырмашылығы аз күш жұмсауды қажет етеді және фракциялардың ең аз санын тез алуға мүмкіндік береді. Алайда, олардың кемшілігі – LC-MS/MS протоколдарымен үйлеспейтін Triton X-100 немесе натрий додецилсульфаты (SDS) сияқты беттік белсенді заттарды қолдану. Жақында жапондық зерттеушілер кейінгі протеомдық талдау үшін натрий деоксихолаты (SDC) және натрий лаурилсаркозинаты (SLS) сияқты үйлесімді реагенттерді қолдана отырып, жасушаішілік фракциялаудың жаңа әдісін ұсынды. Бұл жобада біз бұл әдісті 0.5% Triton-X100 көмегімен дәстүрлі лизис әдісімен салыстырғанда HEK293T және CHO жасушаларының жасушалық фракциясы үшін қолдандық.

Біз LC-MS/MS тандемдік масс-спектрометриясының сұйық хроматографиясы арқылы талдауға арналған үлгілердің аз мөлшерінде SDC қалдық мөлшерін спектрофотометриялық анықтау әдісін оңтайландырдық. Зерттеу барысында біз pН төмен және CL^–, NO₃^– секілді буферлік ерітінділерде кейбір иондардың болуы жағдайында қалған жуғыш заттарды сандық анықтау үшін калибрлеу қисығының сызықтық коллапсына байланысты шектеулерді таптық, әсіресе тұздардың концентрациясы жоғары болғанда. Хлорид, нитрат және қышқыл иондарының болуы су фазасынан хлороформ фазасына өту үшін метилен көк агрегаттарының түзілуіне ықпал етеді, олар да 655 нм толқын ұзындығын сіңіріп, бәсекелестікке әсер етеді. Оңтайландырылған хаттаманы пайдалана отырып, біз бір реттік этил ацетат экстракциясы SDC мөлшерін 20 есе (0,5% – дан 0,025% – ға дейін) төмендететінін көрсеттік. Біз сондай-ақ хлороформ үлгілерін өлшеу үшін полистиролды 96 шұңқырлы планшеттерді пайдалану мүмкіндігін таптық, бірақ қысқа уақыт мерзімінде. Бұл аз мөлшердегі реагенттер және еріткіштермен жоғары өнімді эксперименттер жүргізуге, сондай-ақ статистикалық талдау үшін көбірек өлшеулер жүргізуге мүмкіндік береді.

Күнтізбелік жоспардың екінші кезеңі аясында қазіргі уақытта тандемдік масс-спектрометрияның сұйық хроматография әдісінің DDA режимінде алынған HEK293T және CHO жасушаларының жасушаішілік фракцияларының үлгілеріне талдау жүргізілуде.

Жарияланымдар және қорғау құжаттары

2021 ж.

ОМБССҚК ұсынған отандық басылымда 1 мақала баспаға қабылданды.

Makhsatova Saya, Kulyyassov Arman. Quantification of sodium deoxycholate in proteomics sample preparation using methylene blue // Eurasian journal of applied biotechnology. – 2023.