Жобаның негізгі идеясы адамның цитотоксикалық Т-лимфоциттік рецепторының (CTLA-4) рекомбинантты фрагментіне қарсы моноклоналды антиденелер шығаратын тышқан гибридомаларының штаммын алу болып табылады. Гуманизацияланған антиденелерді алу әдістемесіне сәйкес, қатерлі ісіктің таргет терапиясына арналған препараттарды жасау үшін тышқан гибридомасының штамдары негізгі болып табылады. Жобаны жүзеге асыру болашақта ісік ауруларды таргет терапияға арналған дәрі-дәрмектерді өндірудің отандық технологиясын әзірлеуге мүмкіндік береді.

Маңыздылығы

Қазіргі уақытта иммундық жүйені бақылау нүктелерін блоктау арқылы қатерлі ісік терапиясы кең таралған. Алынған иммундық бақылау нүктелерін блоктайтын биологиялық белсенді молекулалар қатерлі ісіктерді емдеу мен диагностикалаудың тиімді әдістерін әзірлеуге және ісік жасушаларының микроортасында иммундық жүйенің жұмысын зерттеуге пайдаланылады. Т-лимфоциттын PD-1 рецепторы Т- лифоцитты бүлінуға  бағытталған сигналдық жолының бақылау нүктесі болып табылады. CTLA-4 рецепторы осы сигнал нүктелерінің бірі болып табылады.

Жобаның ғылыми жаналығы CTLA-4 рецепторының жасудан тыс рекомбинантты фрагментын өндіретін штамм-продуцентын қалыптастыру және CTLA-4 ақуыздың эпитоптардың кең спектріна моноклоналды антиденелерді алу. Іn vitro жағдайнда және зертханалық жануарлардың тәжірибелік үлгілерде ісікке қарсы иммунитетті күшейту үшін қолдану мүмкіндігі зерттелетін болады. CTLA-4 рецепторының рекомбинантты жасушадан тыс фрагментін өндіретін микроорганизмдер және анти-CTLA-4 моноклоналды антиденелер ісікке қарсы иммунитетті арттыру бойынша ғылыми зерттеулерді одан әрі кеңейтуге жәрдемдесу етеді. Анти-CTLA-4 моноклоналды антиденелерін өндіретін штаммдар гуманизацияланған моноклоналды антиденелерді дамыту бойынша зерттеулерді жәрдемдесу етеді. Алынған продуцент штаммдары ісікке қарсы биологиялық өнімдер өндірісін құру үшін алғышарттар жасайды.

Мақсат

Адамның CTLA-4 цитотоксикалық Т-лимфоцитінің рецепторының жасушадан тыс фрагментіне қарсы моноклоналды антиденелер өндіретін гибрид штамдарын алу болып табылады.

Күтілетін нәтижелер

Зерттеу нәтижесінде адамның CTLA-4 рецепторының жасушадан тыс рекомибинантты фрагментің өндіретін микроорганизмдер штаммдары алынады. Адамның CTLA-4 рецепторының жасушадан тыс рекомибинантты фрагментіңе қарсы моноклоналды антиденелерды өндіретін гибпридома штаммдары алынады және антиденелердын иммунохимиялық қасиетері зерттеледі. CTLA-4 рецепторына қарсы моноклоналды антиденелердың ісікке қарсы белсенділігі зерттеледі. Әлеуметтік, экономикалық, ғылыми-техникалық нәтиже ісікке қарсы иммунитетті арттыру үшін жоғары технологиялық отандық биологиялық өнімдерді өндіру алаңын құру болып табылады. Жобаны жүзеге асыру рекомбинантты ақуыздар мен моноклоналды антиденелерді қатерлі ісік ауруларын емдеуде қолдануды ғылыми негіздеуге жәрдемдесу етеді.

Жобаның жетекшісі

Муканов Қасым Қасенұлы, жобаның жетекшісі, ветеринарных ғылыми докторы, профессор, h-индекс 3 (Author ID в Scopus – 56340590800).

Зерттеу тобының мүшелері

Боровиков С.Н., биологиялық ғылыми кандидаты, доцент. Индекс Хирша (h-index)-2, профиль ( http://orcid.org/0000-0002-9721-9732).

Турсунов К.А., PhD, h-индекс 1 (Author ID Scopus -57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017).

Әдіш Ж., PhD биология ғылымдарының докторанты, ҰБК ғылыми қызметкері.

Каукабаева Г., магистр, ҰБК кіші ғылыми қызметкері.

Жобаның ғылыми жетекшісі мен зерттеу тобы мүшелерінің жоба тақырыбына қатысты жарияланымдары мен қорғау құжаттары

1. Sotnikov, D.V., Barshevskaya, L.V., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K.,Mukantayev, K.K., Ramankulov, Y.M., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic system for serodiagnostics of cattle brucellosis using gold nanoparticles and signal amplification with quantum dots (2020) Applied Sciences (Switzerland), 10 (3), art. no. 738, . https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85081584093&doi=10.3390%2fapp 10030738&partnerID=40&md5= c18d312fdcd6eae186bafa 9cb8b8c62c. DOI: 10.3390/app10030738
2. Mukantayev, K., Kairova, Z., Tursunov, K., Shustov, A., Zhumabekova, S., Ramankulov, E., Mukanov, K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis (2019) Current Topics in Peptide and Protein Research, 20, pp. 41-49. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s0-85080894201&partnerID=40&md5=1337be9c346e87a8efb3f74e5062273b
3. Mukanov, K.K.,Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K., Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor (2019) Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 27 (4), pp. 85-95. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85074484552&doi=10.35118%2fapjmbb.2019.027.4.10&partnerID=40&md5=bb97d2dd250cd7d2e68fcb7c8bf7faeb. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10
4. Sotnikov, D.V., Berlina, A.N., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K.,Ramankulov, Y.M., Mukantayev, K.N., Dzantiev, B.B. Immunochromatographicserodiagnosis of brucellosis in cattle using gold nanoparticles and quantum dots (2019) International Journal of Veterinary Science, 8 (1), pp. 28-34. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s0-85063189960&partnerID=40&md5=c9ba666b2eb9772380eff393ec05e6fd
5. Barshevskaya, L.V., Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., Khassenov, B.B., Baltin, K.K., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K.,Mukantayev, K.K., Dzantiev, B.B. Triple immunochromatographic system for simultaneous serodiagnosis of bovine brucellosis, tuberculosis, and leukemia (2019) Biosensors, 9 (4), art. no. 115. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85072779454&doi=10.3390%2fbios 9040115&partnerID=40&md5=a8180d6dbd30827509d2ac8675c99751 DOI: 10.3390/bios90401152.
6. Sotnikov D.V., Byzova N.A., Zherdev A.V., Eskendirova S.Z., Baltin K.K., Mukanov K.K.,Ramankulov E.M.,Sadykhov E.G., Dzantiev B.B. Express immunochromatographic detection of antibodies against brucellaabortus in cattle sera based on quantitative photometric registration and modulated cut-off level. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, Issue 1, 2015; IF – 0,727.
7. Shevtsov, E. Ramanculov, E.Shevtsova, A.Kairzhanova, P.Tarlykov, M.Filipenko, M. Dymova, G. Abisheva, A.Jailbekova, D.Kamalova, A.Chsherbakov, S. Tulegenov, A. Akhmetova, I. Sytnik, T. Karibaev, K. Mukanov. Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infection, Genetics and Evolution 34 (2015) P.173-180. IF- 2,8.
8. Shevtsova, A. Shevtsov, K. Mukanov, M.Filipenko, D. Kamalova, I. Sytnik, M. Syzdykov, A Kuznetsov, A. Akhmetova, M. Zharova, T. Karibaev, P.Tarlykov, E. Ramanculov. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan.PLOSONE | DOI:10.1371/journal.pone.0167496 December 1, 2016, P.1-16. IF 3.54
9. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ15/3А — продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. Инновационный патент №25095. Мукантаев К.Н., Турсунов К., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Харлампиева Д.Д., Кущева Н.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
10. Штамм гибрид культивируемых клеток животных Mus Musculus L., продуцент моноклональных антител к ре-комбинантному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого ско-та. Авторское свиде-тельство №73446. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Белялова А.Р., Жылкибаев А.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
11. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN17 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN17. Авторское свидетельство №73335. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
12. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN47 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN47. Авторское свидетельство №73328. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
13. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN15 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN15. Авторское свидетельство №73314 1 Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
14. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TprK — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TprK. Авторское свидетельство №73307. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
15. Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/Tp0453 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum Tp0453. Авторское свидетельство №73321. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
16. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 Asia продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа Азия. Авторское свидетельство №88014. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
17. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 О продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа О. Авторское свидетельство №88019. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В.,Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
18. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 А продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа А. Авторское свидетельство №90924. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
19. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/Е3.pET22/gp51 продуцент рекомбинантного gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение №30998. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
20. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/МPRV продуцент рекомбинантного матричного белка вируса бешенства. Удостоверение автора №106743. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К,А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
21. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
22. Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product//Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, — P.36-42. PMID: 28588631.Q4. Цитирование
23. Bulashev, T. Jakubowski, K. Mukantayev, Tursunov, V. Kiyan, A. Zhumalin. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis//Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. DOI: dx.doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
24. Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51//ISSN 1392-2130. VETERINARIJA IR ZOOTECHNIKA (Vet Med Zoot). T. 76 (98). 2018, p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
25. Mukantayev, K., Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D// Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4.
26. Mukantaev KN, Kairova Zh., Tursunov KA, Zhumabekova SH., Ramankulov EM, Mukanov K.K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis//Current Topics in Peptide and Protein Research. – 2019. – Vol.20. http://www.researchtrends.net/tia/article_pdf.asp?in=0&vn=20&tid=26&aid=6375. Q4.
27. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V.Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor//Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. -2019. 27(4), с. 85-95. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10. Q4.
28. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor//Reports of Biochemistry & Molecular Biology.Vol.8, No.4, Jan 2020. http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3.
29. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., &Zhumalin, A. (2018). Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. VeterinarijaIrZootechnika, 76(98), 17–24.
30. Borovikov S., Syzdykova A.,Scharmyschova M., Kiyan V. Thesynthesis of the immunoactive components of the Сampylobacter fetus antigen and the immunization of the laboratory animals for the purposes of synthesis of the specific antibodies. International Journal of Pharmacy & Technology IJPT.-2016.Vol. 8, 27097-27108 P.Q4.
31. Bulashev A.K., Borovikov S.N.,Serikova S.S., Suranshiev Z.A., Kiyan V.S., Eskendirova S.Z. 2016: Development of an ELISA using anti-idiotypic antibody for diagnosis of opisthorchiasis. Folia Parasitol. 63: 025; DOI:10.14411/fp.2016.025; Q3
32. Borovikov S., Aitmagambetova M. S. Results of cattle examination for campylobacteriosis using the polymerase chain reaction method. EEC – EM – Ecology, Environment and Conservation. VOL. 25 (1): 2019. –Р.456–459. (0971765X–India — Scopus) Q4.
33. Borovikov S.N. Оbtaining monoclonal antibodies to cardiac markers I & Т. Joint Conference: German Symposium on Zoonoses Research 2014 and 7th International Conference on Emerging Zoonoses. — Berlin, Germany, October 16-17, 2014.- С.82.
34. Инновационный патент № 30961 Республика Казахстан, МПКG01N 33/53, A61K 39/40. Штамм гибридных культивируемых клеток животных MusmusculusL. — используемый для получения моноклональных антител к препарату сердечного тропонина I/ Боровиков С.Н., Куйбагаров М.А., Cыздыкова А.С., Картабаева Г.О.: заявитель и патентообладатель АО «Казахский агротех.унив-т им. С. Сейфуллина». опубл. 15.03. 2016, Бюл. № 3.

Қол жеткізген нәтижелер

2021 ж.

Адамның CTLA4 рецепторының аминқышқылдары мен нуклеотидтер тізбегі талдауы жүргізілді. MYPPPYYLG тізбегін қамтитын 125 амин қышқылы қалдықтарының өлшемі бар адамның CTLA4 рецепторының жасушадан тыс домені таңдап алынды. E. coli жасушасында ақуыздын тиімді экспрессия үшін CTLA-4 рецептор генінің оңтайландырылған нуклеотидтер тізбегі схемасы және de novo жағдайында CTLA-4 рецептор генінің синтездеу үшін олигонулеотидтер әзірленді. P. pastoris жасушасында экспрессия үшін адамның CTLA-4 рецепторының генін амплификация үшін екі праймер таңдап алынды. Адамның CTLA4 рецепторының генін тасымалдайтын pET28, pET32 және pPICZα векторларына негізделген генетикалық құрылымдардың схемалары әзірленді. Бактериялық экспрессия үшін адамның CTLA4 рецепторының жасушадан тыс домендік гені de novo жағдайларда синтезделді және амплификацияланды. pET28/CTLA-4 және pET32/CTLA-4 экспрессия векторлары және rCTLA-4 және rTrx/CTLA-4 ақуыздарын өндіретін E. coli BL21 жасушалары алынды. Адамның CTLA4 рецепторының жамушадан тыс рекомбинантты доменің тазалайтың және экспрессия жағдайы әзірленді.

2022 ж.

Рекомбинантты rCTLA-4 ақуыздын иммунологиялық және иммунохимиялық сипаттамалары зерттелген. Талдау нәтижесінде біріктірілген MS/MS спектрлеріне сәйкес келетін ең ықтимал белоктардың ең жоғары ұпайы (4950) тек бір CTLA-4 ақуызына сәйкес келді. Рекомбинантты rCTLA-4 ақуыз коммерциялық препарат рекомбинантты B7-1Fc ақуызбен байланыстың жоғары дәрежесімен әрекеттесті. Гибридизация нәтижесінде IgG класындағы және 2х10⁷М^-1-ден 3х10⁸М^-1-ге дейінгі аффиность бар антиденелерді өндіретін бес клон (С9, А5, Н8, А4, Е9) алынды. Гибридомалардың өнімділігі in vitro жағдайнда 20-дан 30 мкг/мл-ге дейін, in vivo жағдайнда 8-ден 16 мг/мл-ге дейін болды. Тазартылған моноклоналды антидене препараттары аффиндық хроматография арқылы алынды.

2023 ж.

Иммунофлуоресценция реакциясында моноклоналды антиденелер MCF-7 жасуша линясымен арнайы әрекеттесті. Макрофагтарды rCTLA-4, rPD-L1 және rPD-1 протеиндерімен ex vivo өңдегенде, содан кейін тышқандарға интраперитонеальді енгізгенде, макрофагтар ісік жасушаларында гомогендік рецепторлармен әрекеттесетін антиденелердің өндірісін белсендіреді. Нәтижелер, макрофагтар  Т- және В- жасушалар тануға қолайлы пішінде ақуыздарды үдерісітін және рак клеткаларында гомегенді рецепторлармен әрекеттесетін антиденелердің өндірісін белсендіретінін көрсетті. Талдау тышқандардағы антидене титріне макрофагтарды өңдеу кезінде ақуыздар концентрациясының әсерін rPD-1/rPD-L1 және rCTLA-4 ақуыздары арасындағы нәтижелердің айырмашылығын көрсетті. Тышқандардағы анти-rPD-1/анти-rPD-L1 антиденелерінің титрлеріндегі айырмашылық қоректік ортадағы ақуыз концентрацияларындағы елеулі айырмашылықтарға қарамастан, шамалы болды. rPD-1/rPD-L1 ақуыздарынан өзгешелігі, rCTLA-4-ке қарсы антидене титрі макрофагтарды in vitro өңдеген кезде ақуыз концентрациясына жоғары тәуелді болды.