Бактериялардың антибиотикке төзімді штаммдарының таралуы қазіргі денсаулық сақтау саласының басты мәселесіне айналуда. Бактериялар арасында ең көп өлім туберкулез қоздырғышы Mycobacterium tuberculosis (Mtb) тудырады. Mtb бірнеше және көптеген дәріге төзімділікке ие. Патогендік геномдағы мутациялардың пайда болуы үшін олардың пайда болуының негізгі негіздерін, атап айтқанда репликация, рекомбинация және жөндеу процестерін түсіну қажет. Бактериялардың репликативті аппараты қатаң бөлінген уақыт ішінде геномдық ДНҚ-ның көшірмесін жасауы керек. Жасушаның бөлінуі кезінде мутация пайда болады. Мұндай мутациялар қате жұпталған нуклеотидтерді жөндеу ферменттерімен жойылады. Бұл жоба қате жұпталған нуклеотидтерді жоюға қатысатын ДНҚ жөндеу ферменттерінің биохимиялық белсенділігін зерттеуді ұсынады.

Өзектілігі        

Бүгінгі таңда микобактериялардағы ДНҚ репарация жүйесі нашар түсінілген күйінде қалып отыр. M. tuberculosis геномының реттілігінде негізді эксцизиялық жөндеу (BER) жүйесіне қатысатын ферменттерді кодтайтын гендердің гомологтары табылғанына қарамастан, нуклеотидті эксцизиялық жөндеу (NER), гомологиялық емес ұшты біріктіру жолдары (NHEJ) және тағы басқа көптеген ферменттердің субстраттық ерекшелігі әлі зерттелмеген..

Escherichia coli модельдік ағзасындағы эксперименттер арқылы алынған білім бактериялардағы ДНҚ жөндеу зерттеулерінің көпшілігінің негізінде жатыр. Прокариоттық жасушаларда бұрын анықталмаған бірқатар ферменттер мен жаңа репарация ферменттерінің функциялары, сондай-ақ Mycobacterium tuberculosis жағдайында жөндеу жолдарының саны айтарлықтай өзгереді. Сонымен қатар, микобактерия геномында қате жұпталған нуклеотидтерді жөндеу механизмінің белгілі гендерінің гомологтары жоқ.

Мақсаты

Жобаның мақсаты қате жұпталған нуклеотидтерді жоюға қатысатын бұрын зерттелмеген ДНҚ репарация ферменттерінің биохимиялық сипаттамасы болып табылады.

Күтілетін нәтижелер

Әлемде де, Қазақстанда да туберкулез проблемасы өте маңызды. Туберкулез қоздырғышының кең таралған желілері қолда бар антибиотиктерге төзімділікке ие болды. Бұл жобаның нәтижелері антибиотикке төзімділіктің пайда болуындағы ДНҚ репарация ферменттерінің рөлін анықтауға алғышарттары бар. Сондай-ақ, ДНҚ репарация ферменттері антибиотиктердің жаңа буынын дамытудың жаңа перспективалық мақсаттарын ұсынады.

Жоба жетекшісі

Абельденов С. К. Хирш Индексі – 3; ResearcherID F-5139-2015;ORCID 0000-0002-6974-9138; Scopus Author ID 56674705400

Зерттеу тобының мүшелері

Тұрғымбаева А. М. Хирш Индексі – 2; ResearcherID N-6857-2017; ORCID 0000-0001-7263-1643; Scopus Author ID 57202383621

Кириллов С. О. Хирш индексі – 1; ResearcherID N-6322-2017; ORCID 0000-0001-6229-5762

Зейн Ұ.Ө.

Жоба басшысының және зерттеу тобы мүшелерінің жарияланымдары мен қорғау құжаттары

1. Genetic identification of Staphylococcus aureus isolates from cultured milk samples of bovine mastitis using isothermal amplification with CRISPR/Cas12a-based molecular assay. Amanzholova M., Shaizadinova A., Bulashev A., Abeldenov S. Vet Res Commun. ‒ 2023. DOI: 10.1007/s11259-023-10212-z
2. Rapid and highly sensitive LAMP-CRISPR/Cas12a-based identification of bovine mastitis milk samples contaminated by Escherichia coli. Shaizadinova A., Amanzholova M., Kirillov S., Bulashev A., Abeldenov S. Journal of Agriculture and Food Research. ‒ 2023, DOI: 10.1016/j.jafr.2023.100721
3. Cloning and characterization of the major AP endonuclease from Staphylococcus aureus. Turgimbayeva A, Zein U, Zharkov DO, Ramankulov Y, Saparbaev M, Abeldenov S. DNA Repair (Amst). 2022
4. Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. PLoS One. 2018 Aug 15;13(8):e0202232. doi: 10.1371/journal.pone.0202232.
5. Obtaining and characterization of monoclonal antibodies against recombinant extracellular domain of human epidermal growth factor receptor 2. Sarina N, Abeldenov S, Turgimbayeva A, Zhylkibayev A, Ramankulov Y, Khassenov B, Eskendirova S. Hum Antibodies. 2018 Feb 5;26(2):103-111. doi: 10.3233/HAB-170327.
6. Characterization of DNA substrate specificities of apurinic/apyrimidinic endonucleases from Mycobacterium tuberculosis. Abeldenov S, Talhaoui I, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramanculov E, Saparbaev M, Khassenov B. DNA Repair (Amst). 2015 Sep;33:1-16. doi: 10.1016/j.dnarep.2015.05.007.

Қол жеткізілген нәтижелер

2023 ж.

Рекомбинантты ақуыздардың әртүрлі формаларын алу үшін ДНҚ репарация ферменттерінің гендерін экспрессиялық векторларға клондау жүргізілді.  Алынған рекомбинантты векторлардың сиквенсі жүргізілді. Рекомбинантты ақуыздардың экспрессиясын оңтайландыру жүргізілді (өндіруші штаммдарды таңдау, температура мен биомасса өсіру уақыты, индуктор концентрациясы бойынша жағдайларды таңдау).  Жоғары тазалықтағы рекомбинантты ақуыздарды алу үшін әртүрлі хроматография әдістерін қолдана отырып, рекомбинантты ақуыздардың жасушалық биомассасы, лизисі және хроматографиялық тазартылуы жасалды.

2024 ж.

Дуплексті ДНҚ субстраттары дайындалды, мысалы: U-22-(5′-TAMRA-d(CACTTCGGAUTGTGACTGATCC)), 22-mer, мұндағы U=2′дезоксиуридин 10-позицияда, комплементарлы олигонуклеотид 22-COMPL-G (5′-) GGATCAGTCACAGTCCGAAGTG). Дуплексті ДНҚ субстраттарының бөлінуін талдау комплементарлы емес позицияда урацил бар субстратқа қатысты фермент белсенділігінің болуын көрсетті.  Оңтайландыру нәтижесінде буфер құрамы анықталды: 25 мМ Hepes-NaOH pH 6,5, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA, 0,1% Triton-X. Екі валентті металл катиондарына тәуелділікті анықтау кезінде реакциялық қоспадағы 2,5 мМ MgCl2 катализге ықпал ететіні анықталды. Құрамында урацил бар субстратты қолдану арқылы бөліну реакциясы 20 нМ субстрат концентрациясын пайдаланған кезде 1,4 мкм фермент концентрациясын пайдалану арқылы максималды белсенділік байқалатынын көрсетті.  Қате жұпталмаған негіз орналасқан жердегі субстраттың бөліну орны анықталды. Бета қысқыштың 2 мкМ концентрациясын пайдаланған кезде субстратты өңдеудің бақылаумен салыстырғанда 20-30%-ға жоғарылағаны анықталды. Дерекқорларды пайдалана отырып, ақуыз серіктестерінің бета-қысқыш мотивтерінің белгілі аминқышқылдарының реттілігі анықталды және белок-ақуыз өзара әрекеттесуіне қатысатын сақталған аймақтарды анықтау үшін салыстырылды. Зерттелетін ферменттің тізбегіне қатысты EYRLF тізбегі бар сақталған аймақ табылды.