Өзектілігі

CRISPR/Cas9 технологиясын қолдана отырып геномды қайта редактирлеу өмір туралы ғылымдардың барлық салаларын айтарлықтай жетістіктерге әкелді және өсімдік шаруашылығындағы ең перспективалы бағыттардың бірі болып саналады, оның артықшылығы – биотикалық және абиотикалық күйзелістерге төзімді жақсартылған өсімдік дақылдарын құру мүмкіндігі. Жасушадағы Cas9 және sgRNA экспрессиясының деңгейі редактирлеу тиімділігіне әсер ететін негізгі факторлардың бірі. Бұл мәселе күшті промоутерлерді қолдану арқылы, сондай-ақ Cas9 нуклеазасын кодтайтын геннің кодон құрамын оңтайландыру арқылы немесе p19-тың ко-экспрессиясы арқылы шешуге болады. шешіледі. Соңғы жылдары Cas9 байланыстырудың арнайылылығын жақсарту үшін және өсімдік геномының мақсатты аймағында мутация жиілігін арттыру үшін де зерттеулер жүргізілуде.

Қазіргі уақытта суықта ұзақ уақыт сақтау кезінде картоп түйнектерінде редуцирленген қантты жинақтауда инвертазаның рөлін көрсеткен көптеген жұмыстар бар, бұл картоп өнімдерін өндіруде қолайсыз сапа болып табылатын түйнектердің тәттіленуіне әкеледі. Қазіргі уақытта РНҚ интерференция және TALEN әдістерін қолдана отырып, түйнектердегі редуцирленген қанттың концентрациясы төмен картоп линиялары құрылды, бұл уақытты қажет етеді, әрдайым тиімді емес және қымбат.

Мақсаты

CRISPR/Cas9 технологиясына негізделген p19 ген экспрессиясының мақсатты мутагенез тиімділігіне әсерін зерттеу, төмен температура әсерінен пайда болатын картоп түйнектеріндегі редуцирленген қантты азайту.

Күтілетін нәтижелер

1. CRISPR / Cas9 жүйесімен, бағыттаушы РНҚ және р19 генімен экспрессиялық векторлар құрылады.

2. Картоп жапырағы мен сабақ экспланттарын Agrobacterium-жанама трансформациялау жүзеге асырылады.

3. Төменгі температура әсерінен картоп түйнегінде редуцирленген қанттың жиналуын ынталандыратын гені нокаутты регенерант өсімдіктері алынады.

4. CRISPR/Cas9 арқылы мақсатты генді редакциялаудың тиімділігі фрагментті талдау және жаңа буынын (NGS) секвенирлеу әдісі арқылы анықталады.

5. Картоп геномымен өңделген түйнектер редуцирленген қант пен акриламидтің деңгейінде талдау жасалады.

Жоба жетекшісі

Манабаева Шуга Аскаровна. Индекса Хирша 5. https://publons.com/researcher/2449535/shuga-a-manabayeva/ ; ResearcherID Web of Science: A-2529-2015 

Зерттеу тобының мүшелері

Түсіпқан Ділнұр, PhD

Ахметоллаева Айнаш Серікқызы, биология ғылымдарының магистрі

Қали Балнұр Рахметқызы, ғылым магистрі

Жоба басшысының және зерттеу тобы мүшелерінің жарияланымдары мен қорғау құжаттары

1. Abeuova L.S., Kali B.R., Rakhimzhanova A.O., Bekkuzhina S.S., Manabayeva Sh.A.  High frequency direct shoot regeneration from Kazakh commercial potato cultivars // PeerJ. –2020. Vol. 2020, Issue 7, 2020, Article number e9447. doi.org/10.7717/peerj.9447Web of Science Q2, Corresponding author
2. Zhumabek A.T., Rakhimzhanova A.O., Bekkuzhina S.S., Ramankulov Ye.M. and Manabayeva Sh.A. Somatic embryogenesis and plant regeneration from upland switchgrass cultivars // Research on Crops. 2020, – Vol. 21, Issue 2, – P. 349-354. 10.31830/2348-7542.2020.059Web of Science Q4, Corresponding author
3. Zhumabek A.T., Abeuova L.S., Mukhametzhanov N.S., Scholthof H.B., Ramanculov Е.M., Manabayeva S.A.Transient expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein gp51 in plants by a recombinant TBSV vector //Journal of Virological Methods. 2018. – Vol. 255. – P. 1-7. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2018.01.016Web of Science Q4, Corresponding author
4. Manabayeva S.A., Shamekova M., Park J-W., Ding X.S., Nelson R.S., Hsieh Y-C., Omarov R.T., Scholthof H.B. Differential requirements for Tombusvirus coat protein and P19 in plants following leaf versus root inoculation. 2013. Virology. Volume: 439 Issue: 2 Pages: 89-96 http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2018.01.011.Web of Science Q3, First author
5. Gao S-J, Damaj MB, Park J-W, Beyene G, Buenrostro-Nava MT, Molina J., Wang X., Ciomperlik J. J., Manabayeva S.A., Alvarado V.Y., Rathore K.S., Scholthof H.B., Mirkov E.T. Enhanced Transgene Expression in sugarcane by co-expression of virus-encoded RNA silencing suppressors //PLoS ONE. 2013. Volume: 8. Issue: 6. Pages: 1-13 http://dx.doi:10.1371/journal.pone.0066046 Web of Science Q2.

Сведения об имеющихся патентах и других охранных документах

1. Манабаева Ш.А., Абеуова Л.С., Раманкулов Е.М. Транзиентная экспрессия генов рекомбинантных белков GFP и Г-КСФ человека в растениях N.benthamiana // Инновационный патент РК. №31056. 16.03.2016.
2. Манабаева Ш.А., Рахимжанова А.О., Раманкулов Е.М. Способ получения гербицидустойчивых трансгенных растений хлопчатника сорта «Туркистан» // Инновационный патент РК. №31284. 20.06.2016.
3. Манабаева Ш.А., Жұмабек А.Т., Раманкулов Е.М. Способ транзиентной экспрессии гена рекомбинантного белка β-1,4 эндоглюканазы Е1 в растениях N.benthamiana с помощью вирусного вектора на основе генома ВККТ. Патент РК. № 32592. 12.12.2017

Негізгі нәтижелер

2021

CRISPR/Cas9 көмегімен картоптың редуцирленген қант деңгейін төмендету үшін вакуолярлық инвертазаны кодтайтын Pain-1 гені таңдалды. Pain-1 генінің 1 және 3 экзондарының бөліктері https://crispr.dbcls.jp/ және http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/ биоинформатикалық бағдарламалардың көмегімен химерлі бағыттаушы РНҚ олигонуклеотидтердің ықтимал модификациялық сайттары және бағыттаушылары ретінде анықталды. Зерттелетін экзондарда NGG тринуклеотидтері талданды және әр тринуклеотид үшін РАМ-ның 5′ ұшында орналасқан 20 нуклеотидтің нуклеотидтік құрамы талданды, геномдағы спецификалық емес байланыс орындарының ең аз саны бар тізбектер таңдалды. Айнымалы бөліктерді BbsI сайттары арқылы бағыттаушы РНҚ-ның тұрақты бөлігіне клондау нәтижесінде аралық векторлық құрылымдар алынды: p203 + T1, p204 + T2, p205 + T3.

CRISPR/Cas9 көмегімен картоптың Pain-1 генін редактирлеу үшін PcUbi промоутері астында Cas9 кодтайтын pMR284 және pMR287 бинарлы экспрессиялық векторлар таңдалды. Экспрессивті кассетаны U6 промоторы астында химерлі бағыттаушы РНҚ pMR284 және pMR287 бинарлы векторларына клондау нәтижесінде, Pain-1 генінің мақсатты сайттарын өзгертуге және картоп геномдық жасушаларындағы CRISPR/Cas9 жүйесінің жұмысына қажетті барлық элементтерді қамтитын, Gateway жүйесі көмегімен PcUbi промоутері бойынша Cas9 кодтайтын бинарлы экспрессиялық векторлар құрылды.

CRISPR/Саѕ9 көмегімен картоптың редуцирленген қант деңгейін төмендету үшін бағытталған мутагенездің тиімділігіне р19 генінің экспрессиясының әсерін зерттеу үшін р19 ақуызын кодтайтын экспрессиялық вектор құрылды.

2022

Ақсор сұрыпының пробиркалық өсімдіктерін микроклонды көбейту ай сайын қаламшелеу көмегімен жүргізілді. Бұл үшін 5-6 жапырақ түзілген картоп өсімдіктері асептикалық жағдайда пробиркадан алынып, қолтық асты бүршігі бар сабақ бөліктері сегменттерге бөлініп, гормонсыз МС қоректік ортасына отырғызылды. Бұл технология агробактериялық трансформация және каллусогенез үшін картоп экспланттарымен бір жыл ішінде жобаны қамтамасыз етуге мүмкіндік берді.

pMR287+3T, pMR287+3T+P19 және pMR284+3T гендік-инженерлік құрылымдар көмегімен картоптың сабақ және жапырақ экспланттарының Agrobacterium-жанама трансформациясы жүзеге асырылды. Картоптың вакуолярлық инвертазасын кодтайтын Pain-1 гені CRISPR/Cas9 көмегімен бағытталған мутагенездің мақсатты гені болып табылады. Картоптың Ақсор сұрыпының барлығы 925 сабақ экспланты және 940 каллусы трансформацияланды. Трансформацияланған сабақ экспланттарының регенерация жиілігі 21,27% құрады, ал каллустарда сәйкесінше 13,33% болды. Регенерант өсімдіктердің ДНҚ-сы Cas9 генінің бар-жоғымен ПТР әдісімен тексерді. 247 регенерант өсімдіктерінің ішінен pMR287+3T векторымен трансформацияланған 60 регенерант-өсімдік және pMR287+3T+P19 векторымен 28 өсімдік оң нәтиже көрсетті. Әрі қарай фрагменттік талдау көмегімен регенерант өсімдіктердің геномында мутациялардың болуы талданды. Ол үшін ұзындығы 356 ж.н. болатын Pain-1 генінің фрагменті ПТР көмегімен амплификацияланып, ScaI сайты арқылы гидролизденді. Үшінші экзондағы барлық төрт локуста мутацияға ұшыраған 135 және 52 нөмірлі регенеранттар таңдалды. ScaI сайты бойынша ішінара гидролизбен 18 регенерант өсімдіктері таңдалды. Pain-1 инвертаза генімен болжамды редактирленген барлық трансформант-өсімдіктердің ДНҚ-сы екі экзонда 3 мақсатты аймақ бойынша реттелуде және талдануды.

2023

Картоптағы қант деңгейін төмендету үшін вакуолярлық инвертазаны кодтайтын VInv геніне бағытталған CRISPR/Cas9 әдісі қолданылды. Отандық картоп сорттарынан РНҚ-ны бөліп алып, VInv генінің 1 және 3 экзондарындағы ықтимал өзгерістерді талдағаннан кейін геномдағы спецификалық емес байланыстардың ең аз саны бар мақсатты тізбектер таңдалды. Cas9 және p19 гендері мен химерлік бағыттаушы РНҚ кіретін бинарлы экспрессия векторлары жасалды. Агробактериялық трансформацияны қамтамасыз ете отырып, Ақсор сортының картоп өсімдіктерін микроклоналды көбейту ай сайын жүргізілді. Картоптың Аксор сортының барлығы 1327 сабақ және 1123 каллус экспланты трансформацияланды. Регенерация жиілігі сабақтың экспланттары үшін 21,2% және каллус үшін 5,8% құрады. Регенерацияланған өсімдіктердің ДНҚ-сы Cas9 және p19 гендерінің болуын растады. Секвенирлеу әртүрлі мутацияларды, соның ішінде алмастыруларды, енгізуді және жоюды анықтады. Геноммен өңделген картоп түйнектеріндегі редуцирленген қант пен акриламидтің құрамын талдау картоп өнімдерін жақсарту үшін CRISPR/Cas9 технологиясын қолданудың маңыздылығын растады.

Жобаның нәтижелері бойынша келесілер жарияланды

1. Tussipkan D ; Manabayeva, SA. Employing CRISPR/Cas Technology for the Improvement of Potato and Other Tuber Crops// FRONTIERS IN PLANT SCIENCE, Q1, https://doi.org/10.3389/fpls.2021.747476
2. Қали Б.Р., Рахимжанова А.О., Манабаева Ш.А. Отандық картоп сұрыптарының тікелей емес регенерациясы // Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің Хабаршысы / Биологиялық ғылымдар сериясы. – Нұр-Сұлтан, 2022. – №2(139). – С.61-69. https://doi.org/10.32523/2616-7034-2022-139-2-61-69