Coxiellaburnetii является этиологическим агентом лихорадки Ку. Предварительные данные, полученные нами, показали высокую серопревалентность антител к данному патогену у населения южного региона Казахстана, тем не менее, эпиднадзор за лихорадкой Ку в РК отсутствует. Основной целью проекта является изучение распространения C. burnetii в южном регионе Казахстана и генотипирование возбудителя. Диагностика лихорадки Ку невозможна без изучения распространенности вызывающего ее патогена, его генотипов, что в дальнейшем позволит обосновать стратегию эпиднадзора, уменьшить опасность распространения инфекции, разработать тест-системы, основанные на особенностях местных штаммов. Работа будет выполняться группой сотрудниковпод руководством д.м.н. Дмитровского А.М., чьи научные интересы лежат в области зоонозных природно-очаговых трансмиссивных инфекций, ПЦР-диагностики и генотипирования.
Лихорадка Ку (коксиеллез) является зоонозной инфекцией и характеризуется множественностью источников и факторов передачи инфекции. Заболевание вызывается Coxiella (C.) burnetii, строго внутриклеточной грамотрицательной бактерией, которая поражает сельскохозяйственных животных и человека. В циркуляцию C. burnetii в природе вовлекаются многие виды млекопитающих, птиц и клещей.
С наибольшей частотой заражение людей происходит прямо или опосредовано от сельскохозяйственных животных. Ведущее значение имеют аспирационный и контактный пути передачи, меньшее — алиментарный. Клинически лихорадка Ку часто проходит под масками других инфекций (грипп, ОРВИ, бруцеллез и др.). Наиболее характерны острое начало, высокая температура, лихорадка длительностью около недели или больше, ознобы, потливость, головные, суставные и мышечные боли, гепатолиенальный синдром, возможно развитие интерстициальной пневмонии, осложнений в виде тромбофлебита, панкреатита. Первые сообщения в печати о лихорадке Ку в Казахстане (и в СССР) были сделаны Е.Н.Бартошевич в 1946 г., когда она описала кратковременные лихорадочные заболевания, встречавшиеся в сельской местности среди жителей южного региона Казахстана, в дальнейшем они были серологически идентифицированы каккоксиеллез. В 1953-1954 гг. лихорадка Ку была подтверждена в Узбекистане, Таджикистане и Кыргызстане. В последующем в работах Х.Ж Жуматова, А.М. Курочкина, А.Ф. Петрова, и других дано описание широкого распространения этой инфекции в Казахстане. При этом на наш взгляд, наибольший интерес представляет южный регион Казахстана в силу развитого на территории животноводства и большого количества частных подворий.
Поскольку симптомы лихорадки Ку являются неспецифическими, заболеваемость лихорадкой Ку как у людей, так и у животных не может быть оценена в большинстве стран. Однако текущие эпидемиологические исследования показывают, что лихорадку Ку следует рассматривать как проблему общественного здравоохранения во многих странах, например, во Франции, Великобритании, Италии, Испании, Германии, Израиле, Греции и др., а также во многих других странах, где лихорадка Ку распространена, но не распознана из-за отсутствия эпидемиологического надзора за заболеванием. Например, в США лихорадка Ку подлежит регистрации только с 1999 г., что привело к увеличению числа случаев заболевания людей на 250% в период с 2000 г. по 2004 г. благодаря мониторингу данной инфекции [15].В Казахстане мониторинг лихорадки Ку не проводится с 1980-х гг., также отсутствует и эпидемиологический надзор за этой инфекцией. Таким образом, на данный момент отсутствует информация о распространённости данной инфекции среди сельскохозяйственных животных и людей в Казахстане.
Тем не менее, с 1995 года среди жителей южного региона Казахстана отмечается рост числа случаев лихорадок невыясненной этиологии, при этом, в большинстве случаев диагноз устанавливается на основании клинико-эпидемиологических данных без лабораторного подтверждения. В этой группе может в значительной доле присутствовать и лихорадка Ку. Также, в регионе регистрируется значительное количество случаев бруцеллеза, учитывая, что клиническая картина и эпидемиологические факторы у этих двух инфекций зачастую не различимы, в этой группе также может присутствовать и лихорадка Ку. Принимая во внимание развитое в южном регионе животноводство, а также регистрацию в южных областях заболеваний со сходными с лихорадкой Ку клиническими проявлениями без этиологической их расшифровки, целью настоящего проекта является выяснение распространенности C. Burnetii в южном регионе РК, основных их резервуаров, генотипирование C. burnetii, а также совершенствование лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за лихорадкой Ку.
Одной из основных задач исследования будет генетическая характеризация штаммов C. burnetii, циркулирующих на территории южного региона Казахстана. Насколько нам известно, исследования подобного рода в Республике ранее не проводились.
изучение распространения C.burnetii в южном регионе Казахстана, проведение генотипирования обнаруженного возбудителя, совершенствование лабораторно-этиологической диагностики лихорадки Ку и разработка стратегии эпидемиологического надзора за лихорадкой Ку в Республике Казахстан.
В рамках выполнения данной задачи будут синтезированы праймеры для генотипирования C. burnetii в биологическом материале. На основании изучения клинико-эпидемиологических проявлений лихорадки Ку у населения в регионе будет разработано стандартное определение случая лихорадки Ку. Выполнение этой задачи позволит внедрить алгоритм диагностики коксиеллеза, определяющий на основании каких критериев необходимо заподозрить случай лихорадки Ку, что требует передачи экстренного извещения и лабораторного обследования на эту инфекцию, какие критерии подтверждают вероятность диагноза и требуют проведение мероприятий в очаге, и какие лабораторные исследования подтверждают его.
Дмитровский А.М., доктор медицинских наук по специальности инфекционные болезни, профессор, заведующий лабораторией, врач-инфекционист. Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4714-3079. ScopusID: 57217423246.WoS ID: AAZ-2816-2020.
Перфильева Ю.В., Ph.D (биология). Индекс Хирша: 3. ORCID: 0000-0001-6803-0773. Scopus ID: 56823500600. WoSID: AAF-9666-2020.
Мамадалиев С.М., доктор ветеринарных наук, профессор, вирусолог, специалист по особо опасным болезням животных. Индекс Хирша: 3. ORCID: 0000-0002-7767-0251. Scopus ID: 37000092700. WoSID: N-8389-2017.
Остапчук Е.О., Ph.D (биология). Индекс Хирша: 3. ORCID: 0000-0002-3771-423X. Scopus ID: 56823472400. WoSID: D-1254-2015.
Бисенбай А.О., PhD-докторант (биотехнология). ORCID: 0000-0002-7109-2534. ScopusID: 57217425178.
Бердыгулова Ж.А.,PhD-докторант (биология), специалист в области вирусологии и молекулярной биологии. Индекс Хирша: 4. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0379-2472. Scopus ID: 23977664200. WoS ID: I-2943-2018.
Березовский Д.В., магистр (медицина), врач гигиенист-эпидемиолог. Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2830-1994. Scopus ID: 57212528777. WoS ID: AAY-6245-2020.
Куатбекова С.А., магистр, специалист в области ветеринарии .ORCID:https://orcid.org/0000-0001-5569-1847. WoS ID:ABA-3202-2020.
2021 год
Проведен сбор и морфологическая идентификация клещей южного региона Казахстана в эпидсезон 2021г. В Туркестанской области собран 1331 клещ, проведен анализ их видового разнообразия. Всего было морфологически идентифицировано 6 видов клещей, принадлежащих к 4 родам: Argaspersicus, Hyalommaasiaticum, H. scupense, H. anatolicum, H. marginatum, Dermacentormarginatus, Haemaphysalissulcata. Аrgaspersicus (48,1%; 640/1331; 95% CI: 45,4-50,7%) и Ha. sulcata (30,10%; 400/1331; 95% CI: 27,7-32,6%) были наиболее распространенными видами собранных клещей.
Были проанализированы образцы крови от скота в южном регионе Казахстана. Были получены сыворотка/плазма из образцов крови от 247 домашних овец (Ovisaries), 25 коз (Caprahircus) и 10 коров (Bostaurus).
Проведен сбор образцов крови от жителей южного региона Казахстана. В эпидемиологический сезон 2021 г было собрано 100 образцов крови от жителей г. Тараз Жамбылской области. Из них получены образцы сыворотки/плазмы. Сбор образцов проходил в больницах и поликлиниках города. Для ИФА было отобрано 92 образца сыворотки. Средний возраст исследуемых был 33,7±8,7 лет (диапазон 23-50 лет), из них 42 женщины (56,1%) и 45 мужчин (43,9%), для 5 доноров пол был не известен.
Был проведен серологический и ПЦР-анализ собранных образцов. Проведено кросс-секционное серологическое обследование 282 сельскохозяйственных животных. Показано, что общая серопозитивность к антигенам I и II C.burnetii среди сельскохозяйственных животных составила 27,7% (29,0%; 78/282; 95% CI: 22,8-33,2%), при этом наибольшее количество сероположительных животных было выявлено в Туркестанской области (32,2%: 46/143; 95% CI: 25,1-40,2%) при сравнении с Жамбылской областью (23,0%; 32/139; 95% CI: 16,8-30,7%). Из 78 сероположительных животных, 66 принадлежали к овцам и 12 к козам. Положительные образцы не были выявлены среди крупного рогатого скота, что, возможно, было связано с малым количеством выборки (n=10). — Анализ ИФА с сыворотками от жителей южного региона Казахстана проводился с применением валидированного набора «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgG к антигенам коксиеллБернета» (ИФА-анти-Ку-G) (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Из 92 проанализированных образцов 3 были позитивными по IgG к C. burnetii. — Из 20 клещей, собранных в Алматинской области и 237 одиночных клещей и 10 пулов клещей (2-3 клеща), собранных в Туркестанской области в эпидемиологический сезон 2021 г., были выделены нуклеиновые кислоты и проведен анализ ДНК методом классической ПЦР с использованием двух пар праймеров. Ожидаемых продуктов ПЦР (738 п.н.о. и 775 п.н.о., соответственно) не было обнаружено ни в одном из проанализированных образцов.
Был проведен эпидемиологический анализ и ГИС-картирование полученных данных. Проведенный серологический анализ установил, что в Туркестанской и Жамбылской областях Казахстана значительная доля домашнего скота (27,7%) имеет антитела к C. burnetii, что свидетельствует о достаточно широкой распространенности коксиеллеза среди сельскохозяйственных животных на обследуемой территории. При этом, наиболее эпизоотически активные очаги выявлены в Байдибекском, Сайрамском и Казыгуртском районах Туркестанской области и в районе Т.Рыскулов Жамбылской области. Выявление региональных особенностей эпидемиологии коксиеллеза показало, что риск серопозитивности в два с половиной раз выше у Caprahircus, что предполагает, что данный вид животных является более уязвимым для инфицирования C. burnetii. Тем не менее, более многочисленное поголовье овец в регионе и наблюдаемая серопревалентность 26,7% среди Ovisaries подчеркивают активное участие этого вида в циркуляции патогена в районе исследования. Серологический анализ образцов сыворотки, полученной от жителей г. ТаразЖамбылской области, показал, что имеется небольшая прослойка населения, имеющая антитела к C. burnetii (3,3%), что свидетельствует о закономерной возможности заражения людей C. burnetii в районе исследования.
2022 год
Проведен сбор и морфологическая идентификация клещей южного региона Казахстана. Проведена гомогенизация собранных клещей и выделение препаратов ДНК.
— Проведен сбор клещей с вегетативной растительности, крупного и мелкого рогатого скота и большой песчанки в 2 районах Туркестанской области (Отырарский и Шардаринский). Собрано 185 клещей, морфологически идентифицировано 5 видов, принадлежащих к 3 родам: Hyalomma (Н.) asiaticum, H. scupense, H. anatolicum, Dermacentor (D) niveus, Haemaphysalis (Ha.) erinacei.
— В эпидемиологический сезон 2022 г. проведен сбор клещей методом «флага» с вегетативной растительности в предгорьях Заилийского Алатау и с укушенных людей и животных. Собрано 66 клещей, проведена их морфологическая классификация. Идентифицировано 4 вида клещей: Ixodes persulcatus (41 клещ), D. marginatus (5 клещей), Haemaphysalis punctata (12 клещей), Rhipicephalus spp (8 клещей).
— Проведено выделение препаратов нуклеиновых кислот из 96 гомогенизатов клещей, собранных в 2021 г в Туркестанской области методом селективной преципитации с использованием набора «РИБО-сорб» (“AmpliSens”).
2023 год
— C целью выявления C. burnetii и последующего секвенирования ДНК проведен сбор клещей из Алматинской и Жамбылской областей в 2023 г. Выполнена их морфологическая идентификация по определительным таблицам с использованием стереоскопического микроскопа Микромед МС-2-ZOOM вар.2А. Проведена гомогенизация 136 единичных искодовых клещей с их последующим пулированием (n=34) и аликвотированием. Выделены тотальные препараты ДНК из 34 пулов клещей методом селективной преципитации с использованием набора «РИБО-Преп» (“AmpliSens”) и проведен их ПЦР-анализ с использованием валидированной коммерческой тест-системы «АмплиСенс® Coxiella burnetii-FL». Выявлены 4 положительных пула. Выделены препараты ДНК из гомогенатов единичных клещей, пулы из которых дали ПЦР-положительный результат. ПЦР-анализ образцов ДНК, полученных из единичных клещей, показал, что общая инфицированность собранных клещей C. burnetii в исследованных районах была равна 2,9% (4/136). Вся информация занесена в базу в формате Excell.
— Проведена амплификация по трем локусам генов icd (ожидаемый продукт 738 п. о.), 16S рРНК (ожидаемый продукт 1459 п. о.) и com1 (амплификация проводилась с использованием двух пар праймеров “CoxBurnetii_com1_F и “CoxBurnetii_com1_R”, “CoxBurn_Com-1ab-F” и “CoxBurn_Com-4ab-R”, ожидаемые продукты 775 и 757 п. о., кроме того проводилась вложенная ПЦР с использованием пары праймеров “CoxBurn_Com-1ab-F” и “CoxBurnetii_com1_R” и массой ожидаемого продукта амплификации 259 п.о.) для 13 образцов ДНК, выделенных из единичных клещей, собранных в 2022 г. и показавших присутствие ДНК C. burnetii, и 3 образцов ДНК, выделенных из крови ПЦР-положительных животных. Проведен электрофоретический анализ полученных продуктов ПЦР-реакции с их последующей визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете на гель-документирующей системе GelDox XR+ (Bio-Rad, США).
— Дополнительно для генетической характеризации детектированных штаммов C. burnetii синтезированы на ДНК-синтезаторе и очищены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии праймеры на транспозонный повторяющийся участок C. burnetii “Trans 1“и “Trans 2“.
— Разработан алгоритм диагностики лихорадки Ку у пациентов с определением титров антител класса IgG к фазе I (хронический коксиеллез) и фазе II (острый коксиеллез) C. burnetii.
— Проведен сбор образцов сыворотки и плазмы крови у пациентов из Туркестанской области (эндемичной по коксиеллезу) с клиническими признаками хронического коксиеллеза (затяжная пневмония, эндокардит) (n=14), их аликвотирование с последующим занесением в базу данных.
— Проведен серологический скрининг населения Жамбылской области (n=316) и Туркестанской области (n=14) на наличие антител к C.burnetii с применением валидированного набора «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса IgG к антигенам коксиелл Бернета» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Для выявления хронической и острой формы лихорадки Ку все положительные образцы далее протестированы на наличие антител к I и II фазе C. burnetii c использованием валидированных наборов anti-Coxiella burnetii (Q-Fever) Phase 1 IgG Human ELISA и anti-Coxiella burnetii (Q-Fever) Phase 2 IgG Human ELISA (Abcam) с последующим определением титров антител в разведениях сыворотки от 1:100 до 1:1600. Проведена интерпретация полученных результатов. Проведено выделение ДНК из образцов сыворотки от резидентов с выявленной хронической формой коксиеллеза (n=4) и их последующий ПЦР-анализ.
— Проведен сбор истории болезни от пациента с выявленным острым коксиеллезом (сбор объективных данных, эпидемиологического анамнеза, результатов лабораторно-диагностического исследования, назначенных медикаментов). Для эпидемиологического расследования выявленного случая острого коксиеллеза проведен сбор образцов крови у лиц, проживающих совместно с больным, а также сбор молока у домашнего скота в подсобном хозяйстве больного. Проведено ИФА-тестирование собранных образцов на наличие антител класса IgG к антигенам C. burnetii с использованием валидированного набора “ID Screen® Q Fever Indirect Multi-species” (IDVet) согласно инструкции фирмы-производителя.
— На основе литературных данных для генетической характеризации детектированных штаммов C. burnetii выбраны и синтезированы на ДНК-синтезаторе с последующим очищением методом высокоэффективной жидкостной хроматографии праймеры, нацеленные на ген молекулярных шаперонов groEL:“Cox-GrF1”(5’—tttgaaaayatgggcgckcaaatggt), “Cox-GrR2” 5’—(cgrtcrccaaarccaggtgc), “Cox-GrF2” (5’—gaagtggcttcgcrtacwtcagacg), “Cox-GrR1” (5’—ccaaarccaggtgctttyac).
— Проведена амплификация с использованием праймеров “Trans 1“и “Trans 2“ для образцов ДНК, выделенных в 2022 из 21 единичного клеща, показавших присутствие ДНК C. burnetii, и из крови 3 ПЦР-положительных животных с последующим электрофоретическим анализом. Амплификаты соответствующего размера не выявлены.
— Проведена амплификация по четырем локусам генов icd (ожидаемый продукт 738 п. о.), 16S рРНК (ожидаемый продукт 1459 п. о.), com1 (ожидаемый продукт 775 п. о.) для 4 образцов ДНК, выделенных из единичных клещей, собранных в 2023 г. и показавших присутствие ДНК C. burnetii согласно результатам коммерческого набора. Проведен электрофоретический анализ полученных продуктов ПЦР-реакции с их последующей визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете на гель-документирующей системе GelDox XR+ (Bio-Rad, США). Получен один амплификат с размером 738 п. о., проведена его очистка из агарозного геля и секвенирование с обоих концов на 24-капиллярном генетическом анализаторе ABI 3500XL (Life Technologies).
— Разработаны:
1) Определение предположительного случая острой лихорадочной или первично-генерализованной формы лихорадки Ку (57 – 68%);
2) Определение предположительного случая вторично-очаговой гепатитной формы лихорадки Ку (23-37%);
3) Определение предположительного случая вторично-очаговой кардитической формы лихорадки Ку (4-10%);
4) Определение предположительного случая вторично-очаговой менинго-энцефалитической формы лихорадки Ку (до 2%);
5) Вероятный случай лихорадки Ку;
6) Подтвержденный случай лихорадки Ку.
— Опубликовна 1 (одна) статья в рецензируемое научное издание, имеющее процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 80 (восьмидесяти): 1) Perfilyeva Y.V., Berdygulova Z.A., Mashzhan A. S. Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Ostapchuk Y.O., Naizabayeva D.A., Cherusheva A. S., Bissenbay A.O., Kuatbekova S., Abdolla N., Maltseva E.R., Nizkorodova A.S., Kulemin M. V., Shapiyeva Z.Z., Sayakova Z. Z., Perfilyeva A. V., Maltseva E. R., Skiba Y.A., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Molecular and seroepidemiological investigation of Сoxiella burnetii and spotted fever group rickettsiae in the southern region of Kazakhstan // Ticks Tick Borne Dis. — 2023. – N.14:102240. doi: 10.1016/j.ttbdis.2023.102240 (Impact Factor-3.7 WOS, Cite Score, Scopus – 91%, 15/73 Insect Science).