Основная идея проекта заключается в разработке иммунохроматографического анализа на основе рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита и моноклональных антител к данному белку. Проект направлен на решение проблем с распространением вируса нодулярного дерматита сельскохозяйственных животных в Республике Казахстан. Полученная экспресс тест-система позволит сократить время постановки диагноза до 10-20 минут. Тест-система предназначена для выявления антител в сыворотке крупного рогатого скота больных нодулярным дерматитом.
Нодулярный дерматит является трансграничным заболеванием и представляет серьезную угрозу для животноводства, оказывая большое влияние на экономическую ситуацию как внутри нашей страны, так и в мире в целом. Заболеваемость среди не вакцинированного поголовья крупного рогатого скота достигает 85%, а смертность не высокая, но в некоторых случаях достигала 40%. На сегодняшний день, в соответствии с требованиями международного эпизоотического бюро, случаи возникновения нодулярного дерматита подлежат обязательному уведомлению. Возбудителем нодулярного дерматита является вирус, относящийся к семейству каприпоксвирусов, куда также входят Shippox и Goatpox вирусы. Заболевание приводит к серьезным потерям продуктивности животных, абортам и проблемам при последующем осеменении, бесплодию быков-производителей, повреждению шкуры, снижению живой массы тела, расходам на проведение оздоровительных мероприятий. Передача вируса от больных животных к здоровым происходит через кровососущих насекомых.
В Казахстане нодулярный дерматит впервые был зарегистрирован в 2016 году, на территории Атырауской области. Предположительно, вирус был занесен с территории соседнего государства, Российской Федерации, где нодулярный дерматит был впервые зарегистрирован в 2015 году. Для профилактики заболевания в 2018 году было вакцинировано 370 тыс. голов крупного рогатого скота оказавшее положительное влияние на эпизоотическую обстановку по нодулярному дерматиту. Учитывая широкую распространённость вируса разработка иммунохроматографического теста на основе рекомбинантного антигена и моноклональных антител для диагностики нодулярного дерматит сельскохозяйственных животных является актуальной для Республики Казахстан и обладает научной новизной.
Конечным продуктом исследования будет иммунохроматографический тест для диагностики нодулярного дерматита. В настоящее время иммунохроматографические тест-системы в мире находят все большее применение в различных отраслях народного хозяйства. Иммунохроматографические тесты применяют для определения инфекционных и внутренних не заразных болезней человека и животных, наркотиков, антибиотиков в продуктах питания и т.д. Необходимо отметить, что в Республике Казахстан применение иммунохроматографических тест-систем в основном ограничилось медицинской сферой при определении беременности.
Повышенный интерес к данной диагностической системе связан с экспрессностью тест-системы (диагноз в течение 10-20 минут), эффективностью (не требует больших трудозатрат и специализированного оборудования, что позволяет проводить обследование в полевых условиях), и достаточно высокой специфичностью и чувствительностью при массовом обследовании. Наличие иммунохроматографических тест-систем для серологической диагностики нодулярного дерматита позволит фермерам оградить себя от приобретения больного скота и тем самым предотвратить дальнейшее распространение инфекции. Ветеринарные специалисты с помощью данной тест системы смогут своевременно выявлять больных животных и тем самым вовремя принять необходимые меры для предотвращения распространения данного заболевания.
Разработка иммунохроматографического анализа для экспресс-диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота на основе рекомбинантного Р32 антигена вируса и полученных к нему специфичных моноклональных антител.
В результате реализации проекта будет разработан иммунохроматографический тест для диагностики нодулярного дерматита сельскохозяйственных животных. Будут получены штаммы микроорганизмов Е. coli продуцирующие рекомбинантный РЗ2 антиген вируса нодулярного дерматита. Изучены диагностические свойства рекомбинантного РЗ2 антигена. Получены 2 линии гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного РЗ2 антигена вируса нодулярного дерматита КРС. Изучены иммунохимические и диагностические свойства моноклональных антител против Р32 антигена вируса нодулярного дерматита.
Турсунов Канат Ахметович, PhD, h-индекс 3 (Author ID Scopus — 57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017)
Әдіш Жансая Батырбекқызы, PhD докторант по специальности биологии. Researcher ID: AAW-7200-2020; Scopus Author ID: 57202535857; ORCID: 0000-0001-9527-8774.
Канаев Дархан Бабанович, магистр биологических наук. Researcher ID: N-6950-2017; ORCID: 0000-0001-9569-9034; Scopus Author ID: 278641.
Тохтарова Лаура Абдихалыковна, магистр технологических наук. (ORCID:0000-0003-4386-993X).
1. Borovikov, S., Tursunov, K., Syzdykova, A., Begenova, A., Zhakhina, A. (2023) Expression of recombinant Omp18 and MOMP of Campylobacter jejuni and the determination of their suitability as antigens for serological diagnosis of campylobacteriosis in animals Veterinary World, 16(1), 222–228. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.222-228. Percentile – 80.
2. Tursunov, K., Tokhtarova, L., Kanayev, D., Mustafina, R., and Mukantayev, K. (2022) Effect of thioredoxin on the immunogenicity of the recombinant P32 protein of lumpy skin disease virus, Veterinary World, 15(10): 2384–2390. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2384-2390. Q2. Percentile – 79.
3. Mukantayev, K., Kanayev, D., Zhumabekova, S., Shevtsov, A., Tursunov, K., Mukanov, K., and Ramankulov Y. (2022) Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan, Veterinary World, 15(8): 2067–2071. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2067-2071. Q2. Percentile – 79.
4. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology, 2020, Vol.8, No.4, http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3. Percentile – 46.
5. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K. Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 2019, 27(4), P.85–95. https://doi.org/10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 Q4.
6. Khilyas, I.V., Tursunov, K.A., Shirshikova, T.V., Kamaletdinova, L.K., Matrosova, L.E., Desai, P. T., McClelland, M., Bogomolnaya, L.M. Genome Sequence of Pigmented Siderophore-Producing Strain Serratia marcescens SM6. Microbiology Resource Announcements, 2019, 8(18). https://doi.org/10.1128/mra.00247-19. Q4, Percentile — 29, Citations — 13.
7. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye. M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 73-84. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.9.
8. Adish Zh., Mukantaev K.N., Tursunov K.A., Kaukabayeva G.K., Kanaev D.B., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining and determination of immunogenic properties of TRX-PD-1 recombinant protein. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.3.
9. Bulashev A., Jakubowski T., Mukantayev K., Tursunov K., Kiyan V., Zhumalin A. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis. Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. www.doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
10. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4.
11. Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51. ISSN 1392-2130. Veterinarija Ir Zootechnika (Vet Med Zoot). T. 2018, 76 (98). p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
12. Mukantayev, K., K. Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D. Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4. Percentile – 45.
13. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4, Percentile — 23, Citations — 4.
14. Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product. Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, P.36-42. PMID: 28588631 PMCID: PMC5454577. Q3, Percentile – 45, Citations — 4.
15. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
16. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/OmpBm-Ba продуцент рекомбинантного химерного белка внешней мембраны бруцелл. Удостоверение автора №104361. Булашев А.К., Турсунов К.А., Жумалин А.Х, Мукантаев К.Н.
17. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3) pET28a/Omp19/31 — продуцент химерного рекомбинантного белка внешней мембраны бруцелл. Патент на изобретение № 35776. 29.07.2022. Булашев А.К., Акибеков О.С., Іңірбай Б.Қ., Мукантаев К.Н., Сыздыкова А.С., Сураншиев Ж.А., Турсунов К.А.
18. Генетическая конструкция Pet28/CTLA-4, обеспечивающая продукцию внеклеточного домена рецептора CTLA-4 человека в трансформированных E.coli. Патент на изобретение № 36343. 18.08.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
19. Генетическая конструкция pET32/P32, предназначенная для экспрессии гена Р32 вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Патент на изобретение № 36373. 22.09.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Іңірбай Б.Қ., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
2021 г.
В условиях de novo получена генетическая конструкция несущая ген Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Проведено клонирование полученного фрагмента ДНК и получены генетические конструкции на основе экспрессионных векторов несущих ген Р32 вируса нодулярного дерматита. Получены штаммы E. coli BL21 (DE3) продуценты рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита с молекулярной массой 47 кДа (rР32Trx/рЕТ32) и 32 кДа (rP32/рЕТ28). Были отработаны методы выделения и очистки рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Аминокислотную последовательность белков проверяли методом масс-спектрометрии. В результате обработки представленного спектра было достоверно показано, что набор триптических пептидов соответствует белку Р32 вируса нодулярного дерматита.
2022 г.
Изучены иммунологические и диагностические характеристики рекомбинантного Р32 антигена вируса нодулярного дерматита. Отработана схема иммунизации лабораторных животных рекомбинантным Р32 белком. Оптимизированы основные параметры постановки непрямого варианта ИФА. Получены две линии гибридных клеток продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного Р32 антигена.Обе линии гибридных клеток (4E2A11 и 8F2E12) продуцируют антитела относящиеся к иммуноглобулину класса G, подкласс 2b, тип легкой цепи – каппа. Константа связывания моноклональных антител, продуцируемых линиями гибридных клеток 4E2A11 и 8F2E12 составила 3×107М-1 и 2×108М-1 соответственно. При наработке препаративного количества моноклональных антител методом in vitro, концентрация антител составила в среднем 43 мкг/мл. Методом in vivo, на мышах линии Balb/c, получено в среднем по 4-5 мг/мл.
2023 г.
Определена специфичность моноклональных антител полученных к рекомбинантному Р32 антигену вируса нодулярного дерматита КРС. Отработаны основные параметры использования рекомбинантного Р32 белка и моноклональных антител к Р32 антигену вируса в иммунохроматографическом анализе. Установлено, что оптимальная концентрация протеина G (рН 6,0) и моноклональных антител (рН 9,0) для иммобилизации на коллоидном золоте, с размером частиц 20 нм в диаметре, составила 20 мкг/мл и 12 мкг/мл, соответственно. Оптимальная концентрация наносимых на мембрану моноклональных антител, антигена и вторичных антивидовых антител составляет 200 мкг/мл, 500-800 мкг/мл и 200-300 мкг/мл, соответственно. Конъюгат и моноклональные антитела специфически связывались с рекомбинантным белком Р32 и не вступали в перекрестную реакцию с другими белками. Отработаны параметры формирования иммунохроматографического теста и определены его диагностические свойства. Чувствительность теста составила 79%, а специфичность 90%.