Основная идея проекта заключается в разработке иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного химерного белка Toxoplasma gondii состоящего из иммунодоминантных последовательностей трех наиболее перспективных антигенов для серологической диагностики токсоплазмоза сельскохозяйственных животных. Проект направлен на решение проблем, связанных с распространением токсоплазмоза среди сельскохозяйственных животных, которые являются основным источником инфицирования человека. Иммуноферментный анализ на основе химерного белка позволит повысить эффективность диагностики и улучшить эпидемиологическую ситуацию по токсоплазмозу.
Токсоплазмоз — широко распространенная зоонозная инфекция, вызываемая внутриклеточным паразитом Toxoplasma gondii, который поражает людей и практически всех теплокровных животных. Заражение человека токсоплазмозом происходит при употреблении в пищу сырого или недоваренного мяса инфицированных животных, а также пищи или воды, зараженных ооцистами. Основными распространителями паразита являются кошки. Они выделяют миллионы ооцист паразитов вместе с фекалиями в окружающую среду, которые после споруляции могут сохранять свою инфекционность в течение длительного времени в воде и почве и ответственны за заражение промежуточных хозяев, включая человека и других животных. В основном, заболевание протекает бессимптомно или может проявляться гриппоподобными симптомами и другими неспецифическими клиническими признаками. Однако у пациентов с ослабленным иммунитетом заболевание может протекать в тяжелой форме и даже приводить к смертельным исходам. Особенно опасно данное заболевание для беременных женщин, так как передается вертикально от матери к плоду через плаценту. Инфекция может привести к серьезным неврологическим или глазным расстройствам с сердечными и мозговыми аномалиями, такими как гидроцефалия, умственная отсталость, судороги, внутриутробная смертность и абортам. У сельскохозяйственных животных, в частности овец и коз, инфекция может привести к аборту, мумификации или мацерации плода, внутриутробной эмбриональной гибели, мертворождению или постнатальной смерти новорожденных, что угрожает выращиванию овец и коз во всем мире. Выживший молодняк чаще всего слабый и восприимчивый к другим заболеваниям. Продуктивность сельскохозяйственных животных в значительной степени зависит от их репродуктивной эффективности. Высокий уровень смертности плода, вызываемый широким спектром простейших, бактерий и вирусов является основной причиной экономических потерь в сельскохозяйственной отрасли, и на фермах по разведению жвачных животных.
Согласно отчету, опубликованному в 2012 году, консультативным комитетом по микробиологической безопасности агентства по стандартам пищевых продуктов, токсоплазмоз человека был второй по значимости причиной смерти от болезней пищевого происхождения в Соединенных Штатах, на него приходилось 24% всех смертей по сравнению с 28% для Salmonella spp. При этом потребление мяса овец было причиной 30% заболеваний человека. Следует отметить, что данные об эпизоотологии токсоплазмоза у крупного и мелкого рогатого скота в Казахстане отсутствуют, в то время как мясо этих животных широко потребляется в стране и может представлять собой важный источник передачи токсоплазмоза человеку.
Благодаря достижениям генетической инженерии, на сегодняшний день появился совершенно новый подход в конструировании рекомбинантных продуктов, так называемых химерных антигенов, которые могут заменить нативные антигены из лизированного цельного паразита. Химерные рекомбинантные антигены могут содержать различные иммунореактивные эпитопы нескольких антигенов T. gondii. Преимущество химерных рекомбинантных антигенов перед отдельными рекомбинантными антигенами заключается в более высокой чувствительности иммунологических тестов и снижении себестоимости конечного продукта. Это связано с тем, что для производства одного химерного рекомбинантного антигена, несущего в себе иммунодоминантные участки трех белков, потребуется значительно меньше затрат по сравнению с получением трех рекомбинантных белков по отдельности. Научная новизна проекта заключается в разработке ИФА тест-системы на основе рекомбинантных химерных антигенов для выявления антител класса IgG в сыворотке крови сельскохозяйственных животных (коров, овец и коз).
Разработка иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного химерного белка, состоящего из комбинации трех наиболее перспективных антигенов для диагностики токсоплазмоза коров, овец и коз.
Будет разработан ИФА тест на основе рекомбинантного химерного антигена для диагностики токсоплазмоза сельскохозяйственных животных. На первом этапе исследований будет проведен анализ известных иммунодоминантных антигенов T. gondii и отобраны три наиболее перспективных белка. Далее будут получены штаммы микроорганизмов, продуцирующие рекомбинантный химерный антиген T. gondii и отработаны параметры его выделения и очистки. На следующем этапе будет проведена препаративная наработка нативного лизированного антигена T. gondii. Методами nanoLC-MS/MS спектрометрии будут изучены биохимические свойства полученного рекомбинантного химерного антигена T. gondii. Будут изучены иммунологические и диагностические свойства белков. На заключительном этапе будут отработаны и оптимизированы основные параметры ИФА теста и изучена его эффективность.
Турсунов Канат Ахметович, PhD, h-индекс 3 (Author ID Scopus — 57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017)
Мукантаев Канатбек Найзабекович, высшее, доктор биологических наук, доцент. h-индекс 4, Researcher ID: AAM-8674-2020; ORCID: 0000-0002-6048-0232; Author ID Scopus: 57211138932.
Әдіш Жансая Батырбекқызы, высшее, PhD докторант по специальности биологии. Researcher ID: AAW-7200-2020; Scopus Author ID: 57202535857; ORCID: 0000-0001-9527-8774.
Канаев Дархан Бабанович, высшее, магистр биологических наук. Researcher ID: N-6950-2017; ORCID: 0000-0001-9569-9034; Scopus Author ID: 278641.
Тохтарова Лаура Абдихалыковна, высшее, магистр технологических наук. (ORCID:0000-0003-4386-993X).
1. Borovikov, S., Tursunov, K., Syzdykova, A., Begenova, A., Zhakhina, A. (2023) Expression of recombinant Omp18 and MOMP of Campylobacter jejuni and the determination of their suitability as antigens for serological diagnosis of campylobacteriosis in animals Veterinary World, 16(1), 222–228. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.222-228. Percentile – 80.
2. Tursunov, K., Tokhtarova, L., Kanayev, D., Mustafina, R., and Mukantayev, K. (2022) Effect of thioredoxin on the immunogenicity of the recombinant P32 protein of lumpy skin disease virus, Veterinary World, 15(10): 2384–2390. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2384-2390. Q2. Percentile – 79.
3. Mukantayev, K., Kanayev, D., Zhumabekova, S., Shevtsov, A., Tursunov, K., Mukanov, K., and Ramankulov Y. (2022) Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan, Veterinary World, 15(8): 2067–2071. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2067-2071. Q2. Percentile – 79.
4. Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor. Reports of Biochemistry & Molecular Biology, 2020, Vol.8, No.4, http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3. Percentile – 46.
5. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K. Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor. Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 2019, 27(4), P.85–95. https://doi.org/10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 Q4.
6. Khilyas, I.V., Tursunov, K.A., Shirshikova, T.V., Kamaletdinova, L.K., Matrosova, L.E., Desai, P. T., McClelland, M., Bogomolnaya, L.M. Genome Sequence of Pigmented Siderophore-Producing Strain Serratia marcescens SM6. Microbiology Resource Announcements, 2019, 8(18). https://doi.org/10.1128/mra.00247-19. Q4, Percentile — 29, Citations — 13.
7. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye. M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 73-84. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.9.
8. Adish Zh., Mukantaev K.N., Tursunov K.A., Kaukabayeva G.K., Kanaev D.B., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining and determination of immunogenic properties of TRX-PD-1 recombinant protein. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2019, Vol.1, 33-42. https://doi.org/10.11134/btp.1.2019.3.
9. Bulashev A., Jakubowski T., Mukantayev K., Tursunov K., Kiyan V., Zhumalin A. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis. Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. www.doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
10. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4.
11. Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51. ISSN 1392-2130. Veterinarija Ir Zootechnika (Vet Med Zoot). T. 2018, 76 (98). p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
12. Mukantayev, K., K. Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D. Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4. Percentile – 45.
13. Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. Veterinarija Ir Zootechnika, 2018, 76(98), 17–24. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/bulashev.pdf Q4, Percentile — 23, Citations — 4.
14. Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product. Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, P.36-42. PMID: 28588631 PMCID: PMC5454577. Q3, Percentile – 45, Citations — 4.
15. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К.А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
16. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/OmpBm-Ba продуцент рекомбинантного химерного белка внешней мембраны бруцелл. Удостоверение автора №104361. Булашев А.К., Турсунов К.А., Жумалин А.Х, Мукантаев К.Н.
17. Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3) pET28a/Omp19/31 — продуцент химерного рекомбинантного белка внешней мембраны бруцелл. Патент на изобретение № 35776. 29.07.2022. Булашев А.К., Акибеков О.С., Іңірбай Б.Қ., Мукантаев К.Н., Сыздыкова А.С., Сураншиев Ж.А., Турсунов К.А.
18. Генетическая конструкция Pet28/CTLA-4, обеспечивающая продукцию внеклеточного домена рецептора CTLA-4 человека в трансформированных E. coli. Патент на изобретение № 36343. 18.08.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
19. Генетическая конструкция pET32/P32, предназначенная для экспрессии гена Р32 вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Патент на изобретение № 36373. 22.09.2023. Мукантаев К.Н., Муканов К.К., Турсунов К.А., Іңірбай Б.Қ., Әдіш Ж.Б., Раманкулов Е.М.
2023 г.
Получена генетическая конструкция на основе вектора pGEM-T, несущая аминокислотную последовательность SAG1, SAG2 и GRA7 белков T. gondii. Для этого, в базе данных NCBI, были отобраны и проанализированы десять белков T. gondii. Далее получена генетическая конструкция на основе экспрессионного вектора рЕТ28, несущая ген химерного белка паразита T. gondii. Полученную рекомбинантную плазмиду трансформировали в электрокомпетентные клетки E. coli BL21(DE3) с помощью электропорации. Положительные колонии нарабатывали в большом объеме на питательной среде и далее определяли экспрессию рекомбинантного белка. Было установлено, что наиболее оптимальная концентрация ИПТГ для экспрессии белка составляет 0,2 мМ, температура инкубации 37°С, оптимальное время инкубации 16-18 часов. Полученный штамм продуцируют рекомбинантный химерный белок с молекулярной массой около 38 кДа. Отработаны методы выделения и очистки рекомбинантного химерного белка.