Основными мероприятиями по профилактике и оздоровлению хозяйств от бруцеллеза и лейкоза крупного рогатого скота являются диагностика и убой зараженных животных. Несмотря на проводимые ветеринарные мероприятия, широкое распространение заболеваний усилило интерес к изучению иммунных контрольных точек для лечения хронических инфекций коров. Было определено, что прогрессирование ВЛКРС увеличивает концентрацию регуляторных Т-лимфоцитов приводящих к повышению продукции трансформирующего фактора роста-β (TGF-β). Повышение TGF-β в свою очередь подавляет экспрессию γ-интерферона (IFN-γ) и фактора некроза опухоли (TNF-α) и подавлению естественных клеток-киллеров (NK). Отмечалась связь сигнального пути рецепторов PD-1/PD-L1 и гена активации лимфоцитов 3 (LAG-3) с инфекцией ВЛКРС. Кроме того, сообщалось о повышение экспрессии CTLA-4 в Т-клетках с прогрессированием инфекции ВЛКРС. Т-лимфоциты, а также продукция цитокинов IFN-γ и TNF-α играют важную роль в создании иммунитета против бактериальных инфекций путем повышения активации макрофагов и дендритных клеток. Однако, на поздних субклинических стадиях активность T-лимфоцитов снижается, что способствует росту бактерий и прогрессированию до клинического заболевания.
Новизна проекта заключается в применении блокирования двух контрольных точек для усиления иммунитета против вирусной и бактериальной нагрузки на организм животных при хронических инфекциях. Недавние исследования показали, что CTLA-4 активируется при хронических вирусных инфекциях и злокачественных новообразованиях, способствуя иммунной дисфункции хозяина. С другой стороны, блокада связывания CTLA-4 и CD80 или CD86 антителами восстанавливает иммунный ответ против этих заболеваний. В ряде исследований, где авторы применяли рекомбинантный бычий CTLA-4-Ig, была доказана функция CTLA-4 ингибирующая иммунитет у крупного рогатого скота. Иммунизация мышей рекомбинантным бычьим CTLA4-Ig индуцировала образования анти-CTLA-4 антител. Анти-CTLA-4 антитела значительно увеличивало продукцию IFN-γ клетками иммунной системы здорового и инфицированного BLV крупного рогатого скота. По данным авторов антитела против CTLA-4 могут быть полезными для разработки новой терапии против инфекции BLV.
Аналогичный эффект наблюдался при блокаде пути PD-1/PD-L1 которая усиливала функцию Т-клеток и приводила к ингибированию пролиферации BLV. Было доказано, что снижение концентрации PD-1+ Т-клеток за счет их связывания с PD-L1 на В-клетках способствовало прогрессированию вирусной инфекции. Лечение макак, инфицированных ВИЧ, и мышей, инфицированных LCMV, антителами к PD-L1 или PD-1 восстанавливало множественные функции ранее истощенных Т-клеток и приводило к элиминации вируса in vivo. По мнению авторов, блокирование пути PD-1/PD-L1 имеет потенциальное клиническое применение для усиления антимикробного иммунитета хозяина для лечения хронических инфекций.
Повысить активность иммунитета коров против ВЛКРС и бруцеллеза блокировкой CTLA-4 и PD-L1 рецепторов с помощью моноклональных антител. Получить штаммы-продуценты рекомбинантных внеклеточных доменов CTLA-4 и PD-L1 рецепторов клеток иммунной системы крупного рогатого скота и специфичных моноклональных антител.
Ожидаемые результаты
В результате проведенных исследований будут получены два штамма микроорганизмов продуцирующих рекомбинантные CTLA-4 и PD-L1 белки крупного рогатого скота. Отработаны условия выделения и очистки рекомбинантных белков и определены их иммунобиологические свойства. Получена библиотека штаммов гибридом продуцирующих моноклональных антител против CTLA-4 и PD-L1 рецепторы крупного рогатого скота. Определены продуктивные характеристики штаммов гибридом и иммунохимические свойства моноклональных антител. Разработаны способы повышения активности иммунитета коров при хронических вирусных и бактериальных инфекциях. Определен синергетический эффект терапии моноклональными антителами при лечении BLV-инфицированных животных. Отработаны дозы применения моноклональных антител против CTLA-4 и PD-L1 рецепторов крупного рогатого скота.
Боровиков Сергей Николаевич. Кандидат биологических наук, доцент. h-индекс — 2, Researcher ID: AAE-7841-2022; ORCID:0000-0002-9721-9732; Author ID Scopus: 56058619600
Мукантаев Канатбек Найзабекович. Доктор биологических наук, доцент. Scopus h-индекс — 4, Researcher ID: AAE-7841-2022; ORCID:0000-0002-9721-9732; Author ID Scopus: 56058619600
Турсунов Канат Ахметович, PhD, Scopus h-индекс 3, Author ID Scopus — 57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017.
Әдіш Жансая Батырбекқызы, PhD докторант по специальности биологии, h-индекс 2, Author ID Scopus – 57202535857.
Канаев Дархан Бабанович, магистр биологических наук, h-индекс 1, Researcher ID Web of Science N-6950-2017.
Тохтарова Лаура. Младший научный сотрудник. ORCID:0000-0003-4386-993X.
Нуртлеу Малика. Младший научный сотрудник. Scopus Author ID: 57202536508; Researcher ID: N-6297-2017; ORCID: 0000-000-1299-8782
1 Abdrakhmanov S.K., Mukhanbetkaliyev Y.Y., Sultanov A.A., Yessembekova G.N., Borovikov S.N., Namet A., Abishov A.A., Perez A.M., Korennoy F.I. // Mapping the risks of the spread of peste des petits ruminants in the Republic of Kazakhstan. Journal Transboundary and Emerging Diseases. 2021; P.1-10. Web of Science Q1.
2 Bulashev A.K., Borovikov S.N., Serikova S.S., Suranshiev Z.A., Kiyan V.S., Eskendirova S.Z. 2016: Development of an ELISA using anti-idiotypic antibody for diagnosis of opisthorchiasis. Folia Parasitol. 63: 025; DOI:10.14411/fp.2016.025; Web of Science Q3.
3 Borovikov S., Syzdykova A.,Scharmyschova M., Kiyan V. Thesynthesis of theimmunoactivecomponents of thecampylobacter fetus antigen and theimmunization of thelaboratoryanimals for thepurposes of synthesis of thespecificantibodies. International Journal of Pharmacy & Technology IJPT. 2016. Vol. 8, P.27097-27108; CiteScore Q4.
4 Borovikov S., Aitmagambetova M.S.Results of cattle examination for campylobacteriosis using the polymerase chain reaction method. EEC – EM – Ecology, Environment and Conservation. VOL. 25 (1): 2019. Р.456–459. CiteScore Q4.
5 Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product // Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18(1). P.36-42. PMID: 28588631. Процентиль – 62. Цитирование — 4.
6 Dmitriy V Sotnikov, Anna N Berlina, Anatoly V Zherdev, Saule Z Eskendirova, Kassym K Mukanov, Yerlan M Ramankulov, Kanatbek N Mukantayev and Boris B Dzantiev. Immuno-chromatographic Serodiagnosis of Brucellosis in Cattle Using Gold Nanoparticles and Quantum Dots // International Journal of Veterinary Science, 2019, 8(1): 28-34. DOI: 10.3390/app10030738. Процентиль – 33. Цитирование – 5.
7 Sotnikov D.V., Berlina A.N., Zherdev A.V., Eskendirova S.Z., Mukanov K.K., Ramankulov Y.M., Mukantayev K.N., Dzantiev B.B. Comparison of Three Schemes of Quantum Dots-Based Immunochromatography for Serodiagnosis of Brucellosis in Cattle // ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences. – 2019. – Vol.14(11). – P. 3711 – 3718. 10.36478/JEASCI.2019.3711.3718. Процентиль – 44. Цитирование – 4.
8 Sotnikov, D.V., Barshevskaya, L.V., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Mukantayev, K.K., Ramankulov, Y.M., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic system for serodiagnostics of cattle brucellosis using gold nanoparticles and signal amplification with quantum dots // Applied Sciences (Switzerland). – 2020. – Vol.10 (3). doi.org/10.3390/app10030738. Q1. Процентиль – 50. Цитирование -2
9 Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor // Reports of Biochemistry & Molecular Biology.Vol.8, No.4, Jan 2020. http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3.
На основе экспрессионного вектора pET28 были спроектированы две генетические конструкции содержащие гены внеклеточных доменов рецепторов PD-1 и CTLA-4 крупного рогатого скота. Гены внеклеточных доменов рецепторов PD-1 и CTLA-4 крупного рогатого скота синтезирован в условиях de novo длинной 600 и 400 пар оснований, соответственно. Секвенирование синтезированного гена показало 100% совпадение с прогнозируемой нуклеотидной последовательностью. Синтезированные гены клонирован в экспрессионную плазмиду pET28 и наработаны в концентрации 208 — 328 нг/мкл, объемом 200 мкл.
В результате трансформации клеток кишечной палочки штамма BL21 генетическими конструкциями pET28/PD-1 и pET28/CTLA-4 получены штаммы продуценты E. coli BI21/pET28/PD-1 и E. coli BL21/pET28/CTLA-4. Штаммы клеток стабильно продуцировали рекомбинантные белки. Молекулярная масса белков составила 21 и 34 кДа соответствующие прогназируемой массе искомых белков. Получены очищенные препараты рекомбинантных CTLA-4 и PD-L1 белков крупного рогатого скота.
В результате гибридизации В-лимфоцитов мышей иммунизированных rCTLA-4 белком с миеломной линией Х63-Аg8.653, из 576 засеянных лунок в 100 отмечен рост клонов гибридных клеток. Из полученных гибридных клеток 8 клонов продуцировали антитела против rCTLA-4 белка. При гибридизации В-лимфоцитов мышей иммунизированных rPD-L1 белком миеломной линией Х63-Аg8.653 из 576 засеянных лунок в 127 лунках отмечено появление клонов гибридных клеток. Из полученных клонов гибридных клеток 14 клонов продуцировали антитела против rPD-L1 белка. Для получения стабильных продуцентов моноклональных антител полученные клоны клонировали 3 раза методом лимитирующих разведений. Для дальнейшей работы были отобраны наиболее перспективные клоны 1с3 и 4h8 продуцирующие mAb против rCTLA-4, и клон 3g2, продуцирующий mAb против rPD-L1 крупного рогатого скота. Константа связывания моноклональных антител (Kaff (M-1)) составила для 1c3 – 2.9×108М-1; 4h8 – 2.7×108М-1 and 3g2 – 6.4×108M-1.