Проект направлен на проведение генетической характеризации генотипов вируса блютанга, циркулирующих в Казахстане и на повышение эффективности мер по контролю этой опасной болезни животных. Хотя территория Казахстана считается благополучной по блютангу (выявленные изоляты вируса отнесены к вакциноподобному топотипу BTV-9w), в южном регионе страны сложились идеальные условия для распространения катаральной лихорадки овец. Сохраняется риск заноса в страну невакцинных изолятов вируса, способных вызывать эпизоотию. Поэтому, помимо стандартно проводимого серологического мониторинга скота, здесь необходимо проводить дифференцирующее выявление топотипа BTV-9w и ПЦР-диагностику переносчиков болезни. Разрабатываемая отечественная тест-система на основе ПЦР в реальном времени позволит сэкономить средства на диагностике и повысить эффективность контроля блютанга в Казахстане.
РНК-содержащий вирус блютанга (BTV) относится к семейству Reoviridae, роду Orbivirus. Геном BTV представлен десятью линейными двухцепочными сегментами РНК. Вирусный геном кодирует пять неструктурных (NS1, NS2, NS3, NS3A, NS4) и семь структурных (VP1-VP7) белков. В настоящее время выделяют 29 серотипов BTV, в рамках которых могут выделяться отдельные топотипы.
Переносчиками вируса являются кровососущие мокрецы рода Culicoides. К КЛО наиболее восприимчивы овцы. Коровы, буйволы, козы и дикие жвачные длительное время могут быть вирусоносителями, не проявляя клинических признаков болезни. Ограниченное тестирование чувствительных к КЛО животных серологическими методами анализа проводится в Казахстане на постоянной основе (в основном тестируется импортируемый скот). Другие исследовательские группы также указывали на выявление на территории Казахстана серопозитивных, а также ПЦР-позитивных по блютангу животных. Однако серотип выявленных образцов определен не был, и не проводилась их генетическая характеристика.
Новизна проекта заключается в проведении полной генетической характеризации казахстанских изолятов BTV, тестировании казахстанских представителей диких жвачных животных и переносчиков Culicoides sp. на присутствие признаков вируса блютанга, а также в разработке новых праймеров для детекции вируса блютанга методом количественной ПЦР в реальном времени и проведения генетической характеризации BTV. Аналогичных исследований в Казахстане не проводилось.
Провести генетическую характеризацию изолятов вируса блютанга, выявляемых в Казахстане, и разработать отечественную тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для их дифференциальной детекции.
Будет проведен ограниченный (таргетный) сбор клинических образцов от животных и насекомых-переносчиков болезни (Culicoides sp.) в рисковых по блютангу районах южного Казахстана и провести их лабораторную диагностику. Будет проведена генетическая характеризация вариантов вируса блютанга, циркулирующих в южном Казахстане. Будет разработана отечественная тест-система на основе ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса блютанга и выявления топотипа West серотипа BTV-9. Будет разработан дизайн набора и упаковки тест-системы, оформить документацию на разработанную тест-систему. Осуществлено производство пробной партии тест-системы и провести контроль ее качества.
Мамадалиев С.М., доктор ветеринарных наук, профессор, вирусолог. Индекс Хирша: 3. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7767-0251. Scopus ID: 37000092700. WoS ID: N-8389-2017.
Жигайлов А.В. – кандидат биологических наук (молекулярная биология). Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9646-033X. Scopus ID: 6508121286. WoS ID: N-6073-2015.
Мальцева Э.Р. – PhD-докторант (биотехнология), специалист в области молекулярной биологии. Индекс Хирша: 2. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9198-695X. Scopus ID: 57202717826. WoS ID: N-4309-2017.
Неупокоева А.С. – магистр биотехнологии. Индекс Хирша: 1. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7257-8037. Scopus ID: 57217703182. WoS ID: N-9341-2017.
Бисенбай А.О. – PhD-докторант (биотехнология). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7109-2534. Scopus ID: 57217425178. WoS ID: AAX-9935-2020.
Найзабаева Д.А. – магистр биотехнологии. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0606-4289. Scopus ID: 57218288692.WoS ID: AAY-5696-2020.
Куатбекова С.А. – магистр, специалист в области ветеринарии.
2021 год
Был проведен ограниченный (таргетный) сбор клинических образцов от животных и насекомых-переносчиков болезни (Culicoidessp.) в рисковых по блютангу районах Южного Казахстана и проведена их лабораторная диагностика
Синтезированы праймеры для детекции и генетической характеризации вируса блютанга с использованием компьютерной программы MEGA-X и ресурса GenBank, проведен анализ геномов различных серотипов и отдельных топотипов вируса блютанга с целью выявления консервативных участков генома. Для детекции нуклеиновых кислот вируса блютанга синтезированы и очищены 2 праймера к консервативным участкам сегмента 10 BTV. Для детекции внутреннего контроля (к гену бета-актина жвачных животных) синтезированы и очищены 2 праймера. Для генетической характеризации генома вируса блютанга синтезированы и очищены 9 праймеров для сегмента 2 BTV-9W, по 6 праймеров для сегментов 1 и 3 BTV-9W, по 4 праймера для сегментов 4, 5 и 6 BTV-9W, 3 праймера для сегмента 7 BTV, по 2 праймера для сегментов 8, 9 и 10 BTV.
Проведен сбор Culicoidessp. в рисковых по блютангу районах южного Казахстана, проведено их видовое определение. Проведена гомогенизация собранных насекомых; из гомогенатов выделена РНК. Проведен анализ литературных источников в отношении распространения в Казахстане представителей мокрецов Culicoidesspp. (Diptera: Ceratopogonidae). Проведен сбор мокрецов в Южном регионе РК. Для всех точек сбора записаны координаты. Проведена визуальная идентификация собранных Culicoidesspp. с использованием определителя насекомых и бинокуляра. Определенные до подрода насекомые распределены по пулам по полу, локации сбора и систематической группе. Среди собранных мокрецов выявлено четыре подродаCulicoidesspp.: Trithecoides, Hofmania, Oaecata и Avaritia. Сформированные пулы мокрецов гомогенизированы на автоматическом гомогенизаторе, из гомогенатов мокрецов с использованием Тризола выделены тотальные препараты РНК.
Проведентаргетный сбор образцов цельной крови и сывороток от животных, восприимчивых к BTV в рисковых по инфекции областях страны. Всего собрано образцов от 520 овец, 27 коз, 11 коров, 27 верблюдов и 20 бухарских оленей. Из крови животных выделены тотальные образцы РНК.
Проведен серологический анализ сывороток животных методом ИФА, общая превалентность составила 6,15% для овец и 3,7% для коз. Среди коров, верблюдов и оленей не обнаружены серопозитивные животные. Проведен ОТ-ПЦР анализ РНК из крови животных. В одном пуле мух-кровососок и в трех образцах РНК из крови овец выявлена нуклеиновая кислота вируса.
2022 год
Проведена генетическая характеризация вариантов вируса блютанга, циркулирующих в южном Казахстане.
— Из десяти ОТ-ПЦР положительных образцов выделены тотальные препараты РНК, проведена реакция обратной транскрипции с использованием высокопродуктивной ревертазы Superscript IV. С этих десяти образов синтезированной кДНК получены амплификаты с использованием высокоточной ДНК-полимеразы (сегменты 2 и 10).
— Проведена генетическая характеризация изолятов вируса блютанга по частично секвенированным Seg-2 и Seg-10 с последующим проведением филогенетического анализа. По обоим локусам все образцы кластеризовались с образцами генотипов вируса BTV-9W.
— Нуклеотидные последовательности секвенированных участков сегментов 2 и 10 BTV, полученные от десяти ОТ-ПЦР положительных животных, выложены в базу данных NCBI, им присвоены номера: OM307411 — OM307420 (сегмент 10) и номера OM307421 — OM307430 (сегмент 2).
Проведена генетическая характеризация методом классической ПЦР позитивных по блютангу образцов.
— Десять ПЦР-положительных образцов (9 – получены от овец, и 1 – от Culicoides sp.) были проанализированы методом классической ОТ-ПЦР по локусу Seg-2 с использованием серотип-специфических праймеров для выявления серотипа. Установлено, что все восемь образцов относятся к серотипу 9.
— Образцы заархивированы и помещены на хранение при – 70°С.
Проведена генетическая характеризация методом секвенирования ДНК ПЦР-позитивных по блютангу образцов. Проведен филогенетический анализ по результатам секвенирования ДНК.
— В отношении восьми ПЦР-положительных образцов проведена амплификация ДНК с использованием высокоточной полимеразы Phusion по локусам Seg-10 и Seg-2.
— Проведено секвенирование ДНК-фрагментов Seg-10 и Seg-2 по Сэнгеру. Проведен филогенетический анализ по результатам секвенирования ДНК в программе MEGA-X. Установлено, что все образцы, серотипа 9, относятся к топотипу “Western”, который включает только мезогенные вакцинные штаммы вируса.
— Подобраны праймеры для генетического полногеномного анализа BTV-9W. Для одного образца РНК проведено полногеномное секвенирование вируса. Проведен анализ генома, и установлено, что вирус не является реассортным: все геномные сегменты наиболее близки генетически к представителям топотипа “West” серотипа 9.
2023 год
— Для разработки отечественной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса блютанга были определены короткие участки вирусного генома, содержащие мишени для ОТ-кПЦР. С использованием праймеров «BTV-9W-2F» и «BTV-9W-1F» амплифицирован фрагмент ДНК размером 542 п.о., включающий мишень для ОТ-кПЦР по Seg-2. С использованием праймеров «BTV-S10-F» и «BTV-S10-R» амплифицирован участок ДНК размером 746 п.о., включающий мишень для ОТ-кПЦР по Seg-10. Оба амплификата напрямую клонированы в вектор pCR2.1-TOPO, используя коммерческий набор TOPO™ TA Cloning™ Kit (Thermo Fisher Scientific) и компетентные клетки E. coli штамма DH5.
— Проведен скрининг ДНК-клонов с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа. Выбранные ДНК-клоны, содержащие вставки необходимых размеров, перевыделены с использованием коммерческого набора для выделения плазмид GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific).