Проект направлен на проведение генетической характеризации генотипов вируса блютанга, циркулирующих в Казахстане и на повышение эффективности мер по контролю этой опасной болезни животных. Хотя территория Казахстана считается благополучной по блютангу (выявленные изоляты вируса отнесены к вакциноподобному топотипу BTV-9w), в южном регионе страны сложились идеальные условия для распространения катаральной лихорадки овец. Сохраняется риск заноса в страну невакцинных изолятов вируса, способных вызывать эпизоотию. Поэтому, помимо стандартно проводимого серологического мониторинга скота, здесь необходимо проводить дифференцирующее выявление топотипа BTV-9w и ПЦР-диагностику переносчиков болезни. Разрабатываемая отечественная тест-система на основе ПЦР в реальном времени позволит сэкономить средства на диагностике и повысить эффективность контроля блютанга в Казахстане.

Актуальность

РНК-содержащий вирус блютанга (BTV) относится к семейству Reoviridae, роду Orbivirus. Геном BTV представлен десятью линейными двухцепочными сегментами РНК. Вирусный геном кодирует пять неструктурных (NS1, NS2, NS3, NS3A, NS4) и семь структурных (VP1-VP7) белков. В настоящее время выделяют 29 серотипов BTV, в рамках которых могут выделяться отдельные топотипы.

Переносчиками вируса являются кровососущие мокрецы рода Culicoides. К КЛО наиболее восприимчивы овцы. Коровы, буйволы, козы и дикие жвачные длительное время могут быть вирусоносителями, не проявляя клинических признаков болезни. Ограниченное тестирование чувствительных к КЛО животных серологическими методами анализа проводится в Казахстане на постоянной основе (в основном тестируется импортируемый скот). Другие исследовательские группы также указывали на выявление на территории Казахстана серопозитивных, а также ПЦР-позитивных по блютангу животных. Однако серотип выявленных образцов определен не был, и не проводилась их генетическая характеристика.

Новизна проекта заключается в проведении полной генетической характеризации казахстанских изолятов BTV, тестировании казахстанских представителей диких жвачных животных и переносчиков Culicoides sp. на присутствие признаков вируса блютанга, а также в разработке новых праймеров для детекции вируса блютанга методом количественной ПЦР в реальном времени и проведения генетической характеризации BTV. Аналогичных исследований в Казахстане не проводилось.

Цель

Провести генетическую характеризацию изолятов вируса блютанга, выявляемых в Казахстане, и разработать отечественную тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для их дифференциальной детекции.

Ожидаемые результаты

Будет проведен ограниченный (таргетный) сбор клинических образцов от животных и насекомых-переносчиков болезни (Culicoides sp.) в рисковых по блютангу районах южного Казахстана и провести их лабораторную диагностику. Будет проведена генетическая характеризация вариантов вируса блютанга, циркулирующих в южном Казахстане. Будет разработана отечественная тест-система на основе ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса блютанга и выявления топотипа West серотипа BTV-9. Будет разработан дизайн набора и упаковки тест-системы, оформить документацию на разработанную тест-систему. Осуществлено производство пробной партии тест-системы и провести контроль ее качества.

Руководитель проекта

Мамадалиев С.М., доктор ветеринарных наук, профессор, вирусолог. Индекс Хирша: 3. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7767-0251. Scopus ID: 37000092700. WoS ID: N-8389-2017.

Члены исследовательской группы

Жигайлов А.В.  – кандидат биологических наук (молекулярная биология). Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9646-033X. Scopus ID: 6508121286. WoS ID: N-6073-2015.

Мальцева Э.Р. – PhD-докторант (биотехнология), специалист в области молекулярной биологии. Индекс Хирша: 2. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9198-695X. Scopus ID: 57202717826. WoS ID: N-4309-2017.

Неупокоева А.С. – магистр биотехнологии. Индекс Хирша: 1. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7257-8037. Scopus ID: 57217703182. WoS ID: N-9341-2017.

Бисенбай А.О. – PhD-докторант (биотехнология). ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7109-2534. Scopus ID: 57217425178. WoS ID: AAX-9935-2020.

Найзабаева Д.А. – магистр биотехнологии. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0606-4289. Scopus ID: 57218288692.WoS ID: AAY-5696-2020.

Куатбекова С.А. – магистр, специалист в области ветеринарии.

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. Perfilyeva Y.V., Shapiyeva Z.Zh., Ostapchuk Y.O., Berdygulova Z.A., Bissenbay A.O., Kulemin M.V., Ismagulova G.A., Maltseva E.R., Skiba Y.A., Sayakova Z.Z., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Tick-borne pathogens and their vectors in Kazakhstan – a review. Ticks and Tick-borne diseases. 2020;11(5):101498. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101498. IF 2.749; Q2; Cite score 5.2; SJR 1.182; percentile 95. 
2. Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Perfilyeva Y.V., Shumilina A.G., Yeraliyeva L.T., Nizkorodova A.S., Kuznetsova T.V., Iskakova F.A., Berdygulova Z.A., Neupokoyeva A.S., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Two case reports of neuroinvasive West Nile Virus infection in the Almaty region, Kazakhstan. IDCases. 2020;21:e00872. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2020.e00872. Cite score 1.0; SJR 0.294; percentile 24.
3. Bissenbay A.O., Zhigailov A.V., Maltseva E.R., Egemberdieva R.A., Skiba Y.A., Mamadaliyev S.M. Borreliosis: a Hidden Threat for Kazakhstan. Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019;2:5-27. DOI: 10.11134/btp.2.2019.2. КОКСОН РК.
4. Остапчук Е.О., Скиба Ю.А., Мамадалиев С.М. Проблемы лабораторной диагностики клещевого боррелиоза. Вестник КазНМУ. 2019;3:58-62. КОКСОН РК.
5. Bissenbay A.O., Zhigailov A.V., Neupokoyeva A.S., Naizabaeva D.A., Skiba Y.A., Dmitrovsky A.M., Shapiyeva Zh.Zh., Mamadaliyev S.M. West Nile fever virus: biology, epidemiology, molecular genetic characteristics and research priorities. Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019;2:28-40. DOI: 10.11134/btp.2.2019.3. КОКСОН РК.
6. Sansyzbay A.R., Erofeeva M.K., Khairullin B.M., Sandybayev N.T., Kydyrbayev Zh.K., Mamadaliyev S.M., et al. An Inactivated, Adjuvanted Whole Virion Clade 2.2 H5N1 (A/Chicken/Astana/6/05) Influenza Vaccine Is Safe and Immunogenic in a Single Dose in Humans. Clinical and Vaccine Immunology. 2013;20(8):1314-1319. https://doi.org/10.1128/CVI.00096-13. IF 3.233; Q2.
7. Mamadaliyev S.M., Sandybayev N.T., et al. Basic results of development of a production technology and control of a pandemic influenza A/H5N1 vaccine. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2011;5:350-353. IF 3.288; Q2.
8. Mamadaliyev S.M., Sandybayev N.T., et al. Development of production technology and pre-clinical testing of a pandemic influenza A/H1N1 vaccine. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2011;5:354-357. IF 3.288; Q2.
9. Chervyakova O.V., Strochkov V.M., Sultankulova K.T., Sandybayev N.T., Zaitsev V.L., Mamadaliyev S.M. Molecular and genetic analysis of NS gene from high pathogenic strains of the avian influenza (H5N1) virus isolated in Kazakhstan. Gene. 2011;476(1-2):15-19. https://doi.org/10.1016/j.gene.2011.02.003. IF 2.984; Q2.
10. Perfilyeva Yu.V., Nizkorodova A.S., Berdygulova Zh.A., Ostapchuk Ye.A., Naizabayeva D.A., Neupokoyeva A.S., Kuznetsova T.V., Shishkina T.S., Abuova G.N., Yegemberdiyeva R.A., Bissenbay A.O., Maltseva E.R., Mamadaliyev S.A., Dmitrovsky A.M.  Detection of IgG against rickettsia typhi: A population-based study in Southern Kazakhstan. Infektološki glasnik. 2019;39(4). https://doi.org/10.37797/ig.39.4.2. SJR 0.104.
11. Мамадалиев С.М., Абдураимов Е.О., и др. Штамм “RT/RIBSP-07/16″ 16 серотип вируса катаральной лихорадки овец, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент РК № 22289. 15.02.2010. Бюл.2.
12. Ершебулов З.Д., Мамадалиев С.М., и др. Штамм “Хуросон-07/4″ 4 серотип вируса катаральной лихорадки овец, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент РК № 22184. 15.08.2012. Бюл.8.
13. Skiba Y., Mokrousov I., Ismagulova G., Maltseva E., et al. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: A country-wide study. Tuberculosis. 2015;9. https://doi.org/10.1016/j.tube.2015.04.012. IF 6.259; Q1.
14. Skiba Y, Mokrousov I, Nabirova D, Vyazovaya A, Maltseva E, Malakhova N, et al. Mycobacterium tuberculosis RD-Rio strain in Kazakhstan. Emerg Infect Dis. 2019 Mar; 25(3): 604–606 doi: 10.3201/eid2503.181179. IF 2.576; Q3.
15. Ismagul A., Yang N., Maltseva E., et al. A biolistic method for high-throughput production of transgenic wheat plants with single gene insertions. BMC Plant Biology. 2018;18:135. https://doi.org/10.1186/s12870-018-1326-1. IF 3.497; Q1.
16. Zhigailov A.V. Alexandrova A.M., et al. Evidence that phosphorylation of the alpha-subunit of eIF2 does not essentially inhibit mRNA translation in wheat germ cell-free system. Frontiers in Plant Science. 2020,11:936. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.00936. IF 4.106; Q1.
17. Nizkorodova A., Suvorova M., Zhigailov A., Iskakov B. The effect of translation promoting site (TPS) on protein expression in E. coli cells. Molecular Biotechnology (ISSN: 10736085). 2020. 62(6-7):1-9. https://doi.org/10.1007/s12033-020-00251-1. IF 1.712; Q3.
18. Akbergenov R.Z., Zhanybekova S.S., Kryldakov R.V., Zhigailov A., et al. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs. Nucleic Acid Research. 2004;32(1):239-247. https://doi.org/10.1093/nar/gkh176. IF 11.501; Q1.
19. Neupokoyeva A., Abaildayev A., et al. Association of variability in the ZNF365 gene with BC in Kazakh population. FEBS J. 2016;283:376-376.

Достигнутые результаты

2021 год

Был проведен ограниченный (таргетный) сбор клинических образцов от животных и насекомых-переносчиков болезни (Culicoidessp.) в рисковых по блютангу районах Южного Казахстана и проведена их лабораторная диагностика

Синтезированы праймеры для детекции и генетической характеризации вируса блютанга с использованием компьютерной программы MEGA-X и ресурса GenBank, проведен анализ геномов различных серотипов и отдельных топотипов вируса блютанга с целью выявления консервативных участков генома. Для детекции нуклеиновых кислот вируса блютанга синтезированы и очищены 2 праймера к консервативным участкам сегмента 10 BTV. Для детекции внутреннего контроля (к гену бета-актина жвачных животных) синтезированы и очищены 2 праймера. Для генетической характеризации генома вируса блютанга синтезированы и очищены 9 праймеров для сегмента 2 BTV-9W, по 6 праймеров для сегментов 1 и 3 BTV-9W, по 4 праймера для сегментов 4, 5 и 6 BTV-9W, 3 праймера для сегмента 7 BTV, по 2 праймера для сегментов 8, 9 и 10 BTV.

Проведен сбор Culicoidessp. в рисковых по блютангу районах южного Казахстана, проведено их видовое определение. Проведена гомогенизация собранных насекомых; из гомогенатов выделена РНК. Проведен анализ литературных источников в отношении распространения в Казахстане представителей мокрецов Culicoidesspp. (Diptera: Ceratopogonidae). Проведен сбор мокрецов в Южном регионе РК. Для всех точек сбора записаны координаты. Проведена визуальная идентификация собранных Culicoidesspp. с использованием определителя насекомых и бинокуляра. Определенные до подрода насекомые распределены по пулам по полу, локации сбора и систематической группе. Среди собранных мокрецов выявлено четыре подродаCulicoidesspp.: Trithecoides, Hofmania, Oaecata и Avaritia. Сформированные пулы мокрецов гомогенизированы на автоматическом гомогенизаторе, из гомогенатов мокрецов с использованием Тризола выделены тотальные препараты РНК.

Проведентаргетный сбор образцов цельной крови и сывороток от животных, восприимчивых к BTV в рисковых по инфекции областях страны. Всего собрано образцов от 520 овец, 27 коз, 11 коров, 27 верблюдов и 20 бухарских оленей. Из крови животных выделены тотальные образцы РНК.

Проведен серологический анализ сывороток животных методом ИФА, общая превалентность составила 6,15% для овец и 3,7% для коз. Среди коров, верблюдов и оленей не обнаружены серопозитивные животные. Проведен ОТ-ПЦР анализ РНК из крови животных. В одном пуле мух-кровососок и в трех образцах РНК из крови овец выявлена нуклеиновая кислота вируса.

2022 год

Проведена генетическая характеризация вариантов вируса блютанга, циркулирующих в южном Казахстане.

— Из десяти ОТ-ПЦР положительных образцов выделены тотальные препараты РНК, проведена реакция обратной транскрипции с использованием высокопродуктивной ревертазы Superscript IV. С этих десяти образов синтезированной кДНК получены амплификаты с использованием высокоточной ДНК-полимеразы (сегменты 2 и 10). 

— Проведена генетическая характеризация изолятов вируса блютанга по частично секвенированным Seg-2 и Seg-10 с последующим проведением филогенетического анализа. По обоим локусам все образцы кластеризовались с образцами генотипов вируса BTV-9W.

— Нуклеотидные последовательности секвенированных участков сегментов 2 и 10 BTV, полученные от десяти ОТ-ПЦР положительных животных, выложены в базу данных NCBI, им присвоены номера: OM307411 — OM307420 (сегмент 10) и номера OM307421 — OM307430 (сегмент 2).

Проведена генетическая характеризация методом классической ПЦР позитивных по блютангу образцов.

— Десять ПЦР-положительных образцов (9 – получены от овец, и 1 – от Culicoides sp.) были проанализированы методом классической ОТ-ПЦР по локусу Seg-2 с использованием серотип-специфических праймеров для выявления серотипа. Установлено, что все восемь образцов относятся к серотипу 9.

— Образцы заархивированы и помещены на хранение при – 70°С.

Проведена генетическая характеризация методом секвенирования ДНК ПЦР-позитивных по блютангу образцов. Проведен филогенетический анализ по результатам секвенирования ДНК.

— В отношении восьми ПЦР-положительных образцов проведена амплификация ДНК с использованием высокоточной полимеразы Phusion по локусам Seg-10 и Seg-2.

— Проведено секвенирование ДНК-фрагментов Seg-10 и Seg-2 по Сэнгеру.  Проведен филогенетический анализ по результатам секвенирования ДНК в программе MEGA-X. Установлено, что все образцы, серотипа 9, относятся к топотипу “Western”, который включает только мезогенные вакцинные штаммы вируса.

— Подобраны праймеры для генетического полногеномного анализа BTV-9W. Для одного образца РНК проведено полногеномное секвенирование вируса. Проведен анализ генома, и установлено, что вирус не является реассортным: все геномные сегменты наиболее близки генетически к представителям топотипа “West” серотипа 9.

2023 год

— Для разработки отечественной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса блютанга были определены короткие участки вирусного генома, содержащие мишени для ОТ-кПЦР. С использованием праймеров «BTV-9W-2F» и «BTV-9W-1F» амплифицирован фрагмент ДНК размером 542 п.о., включающий мишень для ОТ-кПЦР по Seg-2. С использованием праймеров «BTV-S10-F» и «BTV-S10-R» амплифицирован участок ДНК размером 746 п.о., включающий мишень для ОТ-кПЦР по Seg-10. Оба амплификата напрямую клонированы в вектор pCR2.1-TOPO, используя коммерческий набор TOPO™ TA Cloning™ Kit (Thermo Fisher Scientific) и компетентные клетки E. coli штамма DH5.

— Проведен скрининг ДНК-клонов с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа. Выбранные ДНК-клоны, содержащие вставки необходимых размеров, перевыделены с использованием коммерческого набора для выделения плазмид GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific).