Идея проекта заключается в идентификации иммуногенных белков в штаммах Moraxella bovis и Moraxella bovoculi (M.bovis и M.bovoculi) ассоциированных с ИКК, получении рекомбинантных аналогов и оценки их иммуногенных свойств. С помощью иммуноблоттинга с пробами иммунных сывороток крови будет проведен отбор серопозитивных антигенов в составе лизатов и проведена их идентификация с помощью масс-спектрометрии. Из идентифицированных протеинов на основании литературных данных будут выбраны потенциально иммуногенные протеины. Гены кодирующие данные протеины будут идентифицированы в полученных полногеномных данных. Методом ПЦР гены будут амплифицированы и клонированы в экспресионные конструкции для получения рекомбинантных вариантов в E.Coli. На основании полученных результатов будет определен потенциал использования рекомбинантных белков в качестве компонентов вакцин для профилактики ИКК КРС.

Актуальность

Инфекционный кератоконъюнктивит (ИКК) является широко распространенной и высококонтагиозной глазной инфекцией поражающая крупный рогатый скот. Огромные экономические потери, связанные с этим заболеванием, заставляют ученых усиленно продолжать исследования в направлении разработки и усовершенствования методов профилактики. Считается, что патогенез в основном обусловлен действием различных факторов вирулентности бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. При разработке вакцин, в том числе и рекомбинантных,  исследователи в основном ориентируются на использование в качестве иммуногена связующего с поверхностью pili и гемолитического hemolysin (cytotoxin). Тем не менее, моракселлы обладают и другими детерминантами вирулентности, включающие протеазы, фибринолизины, фосфолипазы, наружные мембранные белки. Эти потенциально консервативные антигены дают дополнительные возможности для разработки эффективных вакцин. Необходимого уровня эффективности профилактических препаратов можно достичь при использовании в их составе актуальных компонентов, характерных для локальных серогрупп. Одним из решений может быть наличие в арсенале разработчиков вакцин штаммов-продуцентов рекомбинантных антигенов, моделирующих разнообразные антигенные детерминанты моракселл обладающие иммуногенными свойствами.

Цель

Получение рекомбинантных протеинов M.bovis и M.bovoculi и изучение их иммуногенных свойств

Ожидаемые результаты

• Будет создана коллекция изолятов bovis и M.bovoculi (не менее 50 изолятов)
• Будут получены данные полногеномного секвенирования 50 изолятов bovis и M.bovoculi.
• Будут выявлены протеины с иммуногенными свойствами
• Будут созданы штаммы-продуценты рекомбинантных протеинов bovis и M.bovoculi.
• Будут изучены иммуногенные свойства рекомбинантных протеинов

Руководитель проекта

Жылкибаев Асылбек Айтанулы, PhD по специальности биология (6D060700), https://publons.com/researcher/2064847/assylbek-a-zhylkibayev/

Члены исследовательской группы

Куйбагаров Марат Амангельдыевич, кандидат ветеринарных наук, https://publons.com/researcher/3801534/marat-kuibagarov/

Бердимуратова Калыш Тлеухановна, магистр,  https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56046816700

Камалова Динара Камаловна, магистр.  https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56736413900&eid=2-s2.0-84937954850

Рыскельдина Анара Жанкожаевна, магистр, https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218871763

Атавлиева Сабина Шамшиддинкызы, магистр, https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57204157988&eid=2-s2.0-85082444981 

Публикации по теме проекта

1. Zhylkibayev A., Akishev Z., Khassenov B., Sarina N., Ramankulov Y., Mukanov K. Eskendirova S. Obtaining and characterization of a recombinant LipL32 protein for detection of leptospirosis. Tropical Biomedicine. 2018. 35(1): 280–287. (IF 0.418, Q4, процентиль https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85045504060&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=45227201eaf4670882be278ce6ff253d&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2855895257700%29&relpos=1&citeCnt=1&searchTerm=
2. Sarina N, Abeldenov S, Turgimbayeva A, Zhylkibayev A, Ramankulov Y, Khassenov B, Eskendirova S. Obtaining and characterization of monoclonal antibodies against recombinant extracellular domain of human epidermal growth factor receptor 2. Hum Antibodies. 2018. 26(2):103-111. doi: 10.3233/HAB-170327. (IF 0.38, Q3, процентиль https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85048079562&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=bd0105aac5ea26e90240ed2ffb60095f&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2855895257700%29&relpos=3&citeCnt=1&searchTerm=
3. Abeev A, Zhylkibayev A, Kamalova D, Kusheva N, Nusupbaeva G, Tleumbetova N, Smagul M, Beissenova S, Aubakirova S, Kassenova Z, Demessinova B, Amanbayev A, Ramankulov Y, Shevtsov A. Epidemiological Outbreaks of Measles Virus in Kazakhstan during 2015. Jpn J Infect Dis. 2018 Sep 21;71(5):354-359. doi: 10.7883/yoken.JJID.2017.565. Epub 2018 Jun 29 (IF 0.71, Q2, процентиль 32) https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85057011983&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=bd0105aac5ea26e90240ed2ffb60095f&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2855895257700%29&relpos=2&citeCnt=1&searchTerm=
4. Abetov D., Kiyan V., Zhylkibayev A., Sarbassova D., Alybayev S., Spooner E., Song M., Bersimbaev R., Sarbassov D. Formation of mammalian pre-ribosomes proceeds from intermediate to composed state during ribosome maturation. J Biol Chem. 2019 Jul 12; 294(28):10746-10757. doi: 10.1074/jbc.AC119.008378 (IF 4.02, Q2, процентиль 73) https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85069003400&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=bd0105aac5ea26e90240ed2ffb60095f&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2855895257700%29&relpos=0&citeCnt=1&searchTerm=
5. .Kuibagarov M.A., Kamalova D.K., Shustov A.V., Suminov A.A., Karibaev T.B., Ryskeldina A.Zh., Shevtsov A.B. Moraxella species diversity in infectious bovine keratoconjunctivitis in Northern Kazakhstan //Eurasian Journal of Applied Biotechnology.–2018. – Vol.3. – P.42-47. DOI: 10.11134/btp.3.2018.5 https://biotechlink.org/3-2018/article5
6. Shevtsov A., Ramanculov E., Shevtsova E., Kairzhanova A., Tarlykov P., Filipenko M., Dymova M., Abisheva G., Jailbekova A., Kamalova D., Chsherbakov A., Tulegenov S., Akhmetova A., Sytnik I., Karibaev T., Mukanov K. Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infect Genet Evol. 2015 Aug;34:173-80. Epub 2015 Jul 6. (IF 2.611).doi:10.1016/j.meegid.2015.07.008. https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-84937954850&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=ad77c5620a721b77374de8cb76a22422&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2856736413900%29&relpos=2&citeCnt=19&searchTerm=
7. Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A., Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan//PLoS One.2016Dec1;11(12):e0167496.eCollection2016.(IF 2.776) DOI:10.1371/journal.pone.0167496 https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85000400609&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=ad77c5620a721b77374de8cb76a22422&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2856736413900%29&relpos=1&citeCnt=12&searchTerm=
8. Shevtsov A., Syzdykov M., Kuznetsov A., Shustov A., Shevtsova E., Berdimuratova K., Mukanov K., Ramankulov Y. Antimicrobial susceptibility of Brucella melitensis in Kazakhstan. Antimicrob Resist Infect Control. 2017 6(130). (IF 3.224) DOI:10.1186/s13756-017-0293-x https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85039555995&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=bab3dc49c2952481265b844477378c15&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2856046816700%29&relpos=1&citeCnt=2&searchTerm=
9. Shevtsova E., Vergnaud G., Shevtsov A.B., Shustov A., Berdimuratova K., Mukanov K., Syzdykov M., Kuznetsov A., Lukhnova L., U.Izbanova, M. L.Filipenko, E.Ramanculov. Genetic diversity of Brucella melitensis in Kazakhstan in relation to world-wide diversity//Frontiers in Microbiology, print 2019 (IF 4.2). DOI:10.3389/fmicb.2019.01897 https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85071928031&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=bab3dc49c2952481265b844477378c15&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2856046816700%29&relpos=0&citeCnt=1&searchTerm=
10. Kairzhanova A.D. , Karibaev T.B. , Shvedyuk V.B. , Tyulegenov S.B. , Zharova M.K.2, Shevtsova E.S. , Kuibagarov M.A. , Shevtsov А.B.  Analysis of genetic homogeneity of bacillus anthracis vaccine strains STI-1 and B. anthracis 55-VNIIVVIM by MLVA-25 // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. – 2017. – №3. – P. 25-32. DOI: 10.11134/btp.3.2017.4 https://biotechlink.org/3-2017/article4
11. Kim Y.G., Baltabekova A.Z., Zhiyenbay E.E., Aksambayeva A.S., Shagyrova Z.S., Khannanov R., Ramanculov E.M., Shustov A.V., Recombinant Vaccinia virus-coded interferon inhibitor B18R: Expression, refolding and a use in a mammalian expression system with a RNA-vector, PLoS One 12(12) (2017) e0189308. DOI: 10.1371/journal.pone.0189308 https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85037344845&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=8afe00ff821e4fc9cea7f10eae84f863&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2856737549000%29&relpos=1&citeCnt=4&searchTerm=
12. Tarlykov P., Atavliyeva S., Alenova A. et al. Draft Genome Sequence of an Extensively Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolate, 3485_MTB, from Nur-Sultan, Kazakhstan //Microbiology Resource Announcements. ‒ 2020. ‒ Vol.9, №10. ‒ P.e00025-00020. DOI 10.1128/MRA.00025-20. https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-85082444981&origin=resultslist&sort=plf-f&src=s&sid=78b240889ec72aca9c33ac0508ee9752&sot=autdocs&sdt=autdocs&sl=18&s=AU-ID%2857204157988%29&relpos=0&citeCnt=0&searchTerm=
13. Atavliyeva S., Tarlykov P., Zholdybayeva E., Ramankulov Ye. Mass spectrometry-based approaches to characterization of the Mycobacterium tuberculosis Eurasian Journal of Applied Biotechnology. – 2018. – №.4 – С.18-26. DOI: 10.11134/btp.4.2018.3 https://biotechlink.org/4-2018/article3
14. P. Tarlykov, S. Atavliyeva, L. Abeuova, S. Manabayeva A MALDI-TOF analysis of gliadins and glutenins in “Astana” wheat cultivar Journal of Biotechnology. – 2019. – Vol.305S. ‒ P.21 DOI: 10.1016/j.jbiotec.2019.05.083 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165619302470?via%3Dihub

Достигнутые результаты

2020 г.

Проведены научно-исследовательские работы, направленные на получение изолятов Moraxella spp, ассоциированных с ИКК КРС. Собрана коллекция из14 изолятов Moraxella bovoculi и 9 изолятов Moraxella bovis, видовая идентификация подтверждена методом анализа фрагмента 16S rRNA гена.

Проведена оценка резистентности изолятов к некоторым антимикробным препаратам. Определена чувствительность большинства изолятов M. bovoculi к хлорамфениколу (86%), цефтриаксону (92%), меропенему (86%). Зарегистрирована чувствительность изолятов M. bovis к хлорамфениколу (77%), меропенему (88%).

2021 г.

Выделено 54 изолята бактерий, ассоциированных с инфекционным кератоконъюнктивитом (ИКК) крупного рогатого скота (КРС), которые были генотипированы методом анализа фрагмента 16S rRNA гена. В результате было идентифицировано 54 изолята включающих: Moraxella bovoculi – 44, Moraxella bovis – 5, Moraxella lacunata – 1, Mannheimia glucosida– 2, Acinetobacter lwoffii– 1, Desemzia incerta – 1. Таким образом,  с учетом ранее проведенных работ, коллекция Moraxella spp составила 72 изолята, из них: Moraxella bovoculi – 58, Moraxella bovis – 14. Чувствительности 72 изолятов Moraxella spp к антимикробным препаратам изучали диско-диффузионным методом. В результате полногеномного секвенирования  44 изолята Moraxella bovoculi и 6 изолятов Moraxella bovis было сгенерировано 18,9 млрд. прочтенных нуклеотидов. Согласно результату было получено: от 891156 до 1855088 прочтений на образец, со средними длинами от 172 п.н. до 277 п.н.

Для определения серопозитивных антигенов проводили преинкубацию лизатов гемолитических штаммов M.bovis и M.bovoculi с пробами иммунных сывороток крови от КРС с клиническими признаками ИКК с дальнейшей преципитацией иммунных комплексов с помощью конъюгата протеина G с магнитными частицами (Protein A/G Magnetic Beads). Полученные таким образом очищенные препараты отправлялись на масс-спектрометрический анализ с последующим анализом данных с помощью программного обеспечения Mascot (Matrix Science) с использованием базы данных SwissProt и NCBI.

Для идентификации иммуногенных протеинов на основании полногеномных данных было проведено аннотирование двух изолятов Moraxella bovis и Moraxella bovoculi, характеризующихся наилучшими значениями метрик сборки геномов. Для Moraxella bovis было получено 239 контигов, общая длина которых составила 2688408 п.н. и N₅₀ 20189. Для Moraxella bovoculi было получено 46 контигов, общая длина которых составила 2048241 п.н. и N₅₀ 80065. По результатам аннотирования геномов: у изолята Moraxella bovis было идентифицировано 2671 кодирующих последовательностей, а у изолята Moraxella bovoculi было идентифицировано 1884 кодирующих последовательностей. Полученные сборки геномов были импортированы в базу данных программы Mascot (Matrix Science), что позволило идентифицировать 6 генов кодирующие иммуногенные протеины.

2022 г.

С целью получения штаммов-продуцентов рекомбинантных протеинов, целевые гены были амплифицированы с матрицы суммарных ДНК, выделенных с изолятов M.bovis и M.bovoculi. Фрагменты ожидаемых длин были очищены гель-электрофорезом, клонированы в подходящем векторе (pGEM-T). С помощью секвенирования было подтверждено соответствие синтетических генов расчётным последовательностям. Для создания экспрессионных конструкций гены M.bovis и M.bovoculi  были клонированы в состав плазмидных векторов для экспрессии. Для упрощения очистки целевые рекомбинантные антигены содержали в аминокислотных последовательностях гексагистидиновые метки. На первом шаге очистки была использована металлоаффинная хроматография (IMAC). На последующих этапах очистки использовали ионообменную хроматографию.