Устойчивость к антибиотикам является серьезной проблемой для здравоохранения во всем мире. Существует острая необходимость в разработке новых антибактериальных мишеней.
Бактериальные патогенны постоянно подвергаются широкому спектру повреждений ДНК. Несмотря на то, что механизмы репарации ДНК хорошо изучены, гораздо меньше известно об этих процессах у таких важных бактерий, как Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus и т.д. Необходимо понять, как широкая группа клинически значимых бактерий репарирует повреждения геномной ДНК. Изучение репарации ДНК важно для понимания процессов, ведущих к антибиотикорезистентности бактерий в организме человека.
Постоянное использование антибиотиков, самолечение и воздействие инфекций в больницах спровоцировало появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). К 2050 году 10 миллионов жизней в год и 100 триллионов долларов экономической нагрузки могут быть результатом роста числа лекарственно-устойчивых инфекций. На сегодняшний день, каждый год от резистентных бактерий умирают около 700 000 человек. Одним из методов борьбы является разработка новых лекарственных препаратов.
Растущее число устойчивых к противомикробным препаратам патогенных микроорганизмов, которые все чаще ассоциируются с внутрибольничной инфекцией, ложится значительным бременем на системы здравоохранения и влечет за собой глобальные экономические издержки.
Более глубокое понимание механизмов возникновения мутаций может заложить основу в прогнозировании неизвестных механизмов устойчивости к антибиотикам, фундаментальные аспекты которых, возможно будет применить к патогенам с МЛУ.
Находясь в организме, патогены постоянно подвергаются влиянию агентов окислительного стресса, что приводит к повреждениям ДНК. Репарация повреждений ДНК играет важную роль в поддерживании стабильности геномов возбудителей. Ферменты репарации имеют огромную функциональную значимость в защите бактерий. Появляются публикации, подчеркивающие необходимость исследований ферментов репарации в качестве новых лекарственных мишеней.
Впервые будет биохимически охарактеризован фермент репарации ДНК Nfo в комплексе с белком-партнером DnaN (бета-субъединица ДНК полимеразы III) у клинически значимого патогена Staphylococcus aureus. Предполагается, что мутации в генах ферментов репарации ДНК могут способствовать адаптации и персистированию патогенов в организме. Мутантные фенотипы, образующиеся после мутаций в генах репарации ДНК, были описаны в бактериях и были ассоциированы с появлением лекарственно-устойчивых штаммов. Антибиотики на сегодняшний день нацелены только на ферменты, которые синтезируют белок, нуклеиновые кислоты, клеточные стенки и т.д. Фундаментальная новизна этой работы заключается в расширении спектра целей, включающих фермент репарации ДНК.
Структурно-функциональное изучение фермента репарации ДНК у S.aureus, являющегося частой причиной внутрибольничных инфекций.
Полученные результаты предоставят критические идеи, каким образом репарационные механизмы ассоциированы с резистентностью патогена к генотоксическому стрессу. Понимание механизмов репарации ДНК предложит новые стратегии борьбы с инфекциями и появлением устойчивости к антибиотикам.
Абельденов Сайлау Касенович, PhD, Web of Science ResearcherID F-5139-2015
Тургимбаева Айгерим Макашкызы, Web of Science ResearcherID N-6857-2017
Кириллов Савелий Олегович, Web of Science ResearcherID N-6322-2017
2020 г.
С помощью секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК и анализа белкового профиля была подтверждена принадлежность имеющейся культуры бактерии S. aureus.
Из геномной ДНК S. aureus были амплифицированы гены nfo и dnaN, экспрессирующие АП эндонуклеазу Nfo и β-субъединицу ДНК-полимеразы III DnaN, соответственно. Полученные гены были клонированы в промежутоный вектор pGEM-T с целью сиквенсного анализа, наработки и хранения. Согласно результатам сиквенса, идентичность нуклеотидной и аминокислотной последовательностей полученных генов с последовательностями с базы данных NCBI составляет 100%.
Таким образом, были получены генетические конструкции pGEM-T/SaNfo, pGEM-T/SaDnaN.
2021 г.
Получены генетические конструкции с клонированными генами nfo и dnaN. С помощью методов секвенирования экспериментально подтверждено отсутствие мутаций в виде делеций, вставок и замен. Проведена трансформация клеток различных экспрессионных штаммов E. coli, подобраны условия экспрессии и очистки и наработаны различные формы рекомбинантных белков Nfo и DnaN. Определена репарационная активность белка Nfo в условиях in vitro и определена его субстратная специфичность в отношении модифицированных оснований. Добавление двухвалентных катионов в значительной степени стимулирует активность репарации ДНК, указывая на то, что Nfo является металл-зависимым ферментом. АП эндонуклеазная активность была стимулирована в присутствии ионов Mn2+, Mg2+, Ca2+. Определены кинетические параметры констант связывания белков Nfo и DnaN с флуоресцентно мечеными ДНК-зондами. Проведены работы по кристаллизации ферментов. Время кристаллизации составляло 7-14 дней.
2022 г.
Проведено гомологичное моделирование. Проведены клонирование и очистка мутантных форм Nfo и DnaN Staphylococcus aureus. Проведено измерение чувствительности мутантных линий Escherichia coli к алкилированным и окислительным повреждениям ДНК при комплементации Nfo. Проведены работы по определению структуры Nfo.
2022 г.
Азнабаева Р.Б., Тургимбаева А.М., Зейн Ұ.Ө., Абельденов С.К. Пептидные последовательности для белок-белковых взаимодействий скользящего зажима // Вестник Карагандинского университета». Серия «Биология, медицина, география. – 2022