Идея проекта заключается в разработке технологии ферментативного гидролиза пластиковых отходов с помощью микробиальных ферментов– ПЭТ-гидролаз и штаммов с ПЭТ-гидролитической активностью. Проект включает в себя поиск штаммов с ПЭТ-гидролазной активностью, получение и изучение гидролизующих полиэтилентерефтолат ферментов. Будет осуществлено изучение ПЭТ-гидролаз, определение полиэтилентерефтолат гидролитической активности микроорганизмов. Основная проблема, на которую нацелен проект – это разработка технологии биодеградации ПЭТ-пластиковых отходов на полигонах и конверсии полиэтилентерефтолата.

Актуальность

Полиэтилентерефталат (ПЭТ) является одним из самых популярных и востребованных материалов, используемых в различных областях. ПЭТ производят в основном из сырой нефти и его производство превышает 30 млн. тонн в год. Этот полимер состоит из повторяющихся единиц терефталевой кислоты и этиленгликоля. Прочность, химическая стойкость, прозрачность и другие качества ПЭТ сделали его удобным упаковочным материалом. Однако, высокая химическая устойчивость и механическая прочность ПЭТ вызывает трудности при его утилизации и/или повторного использования.

Научная новизна проекта заключается в изучении новых ферментов — ПЭТ-гидролаз, их модификации с целью улучшении гидролитических свойств и стабильности. Практическая значимость проекта заключается в получении новых биопрепаратов, ориентированных на использовании в утилизации пластиковых отходов – их распада на простые вещества безопасные для окружающей среды. Результаты проекта могут использоваться как для гидролиза ПЭТ-отходов на исходные вещества: терефталевую кислоту и этиленгликоль для последующего синтеза ПЭТ продукции, так и для полной биоутилизации отходов ПЭТ-гидролитическими микроорганизмами.

Цель

Цель проекта заключается в получении, изучении и направленной модификации ПЭТ-гидролаз бактериального происхождения для биоутилизации и конверсии ПЭТ-пластиковых отходов.

Ожидаемые результаты

Будет осуществлен сбор микроорганизмов из мест скопления пластиковых отходов: почва с территорий мусорных полигонов, мест скопления твердых бытовых отходов. Идентификация выделенных изолятов будет проводиться на основании морфологического, биохимического, молекулярно-генетического и протеомного анализа штаммов. В результате будет создана коллекция штаммов с ПЭТ-гидролизующей активностью. Будут выделены ПЭТ-гидролазы. Их идентификация будет проводиться на основании молекулярной массы, данных 2D-электрофореза и результатов масс-спектрометрического эксперимента. С помощью методов генной инженерии будут получены рекомбинантные ПЭТ-гидролазы, которые будут очищены. Будут изучены биохимические характеристики нативных и модифицированных ПЭТ-гидролаз. Установлены значения ферментативной активности, влияние рН и температуры на активность ферментов, определены температурная и pH стабильность ферментов, изучено влияние ионов металлов, растворителей, детергентов; определена субстратная специфичность и установлены кинетические характеристики.  Будут проведены модельные эксперименты по ферментативному гидролизу ПЭТ-пластиковых отходов. Будет определена степень гидролиза полиэтилентерефтолата и будут идентифицированы продукты гидролиза. Будут проведены модельные эксперименты по гидролизу и биоутилизации ПЭТ-пластика с помощью ПЭТ-гидролизующих микроорганизмов. Будет оценена степень деградации ПЭТ-пластика, прирост микробной массы и влияние сопутствующих факторов на биодеградацию.

Будут использованы методы микробиологии, биохимии, протеомики, молекулярной биологии, биотехнологии.

Руководитель проекта

Силаев Дмитрий Витальевич (Scopus Author ID: 57219323485, ResearcherID: AAQ-8940-2020, ORCID: 0000-0001-6867-953X)

Члены исследовательской группы

Хасенов Бекболат Бауржанович (Scopus Author ID: 36096620800, ResearcherID: AAM-8657-2020, ORCID: 0000-0003-4572-948X)

Кирибаева Асель Калиаскаровна (Scopus Author ID: 57215499873, ResearcherID: N-6774-2017, ORCID: 0000-0002-8293-2340)

Мусахметов Арман Сартамбаевич (Scopus Author ID: 57203751227, ResearcherID: AAQ-9945-2020, ORCID: 0000-0002-6182-3487)

Сарсен Арайлым (ResearcherID: AED-8089-2022 ORCID: 0000-0002-6071-430X)

Шамсиева Юлия (ResearcherID: AFX-3509-2022 ORCID: 0000-0002-3136-6000)

Публикации и охранные документы руководителя проекта и членов исследовательской группы, касающиеся темы проекта

1. Aktayeva S., Baltin K., Kiribayeva A., Akishev Zh., Silayev D., Ramankulov Ye., Khassenov B. Isolation of Bacillus sp. A5.3 Strain with Keratinolytic Activity // Biology (MDPI). 2022, Vol 11, Issue 2, e244. https://doi.org/10.3390/biology11020244. Q1, Impact Factor 5.168, Cite Score 3.3, Percentile 79.
2. Kiribayeva A., Mukanov B., Silayev D., Akishev Zh., Ramankulov Ye., Khassenov B. Cloning, expression, and characterization of a recombinant xylanase from Bacillus sp. T6 // PLoS One. 2022. Vol.17(3). e0202232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202232. Q2, Impact Factor 3.24, Cite Score 5.3, Percentile 92.
3. Nurtaza A., Magzumova G., Yessimseitova A., Karimova V., Shevtsov A., Silayev D., Ramankulov Y., Kakimzhanova A. Micropropagation of the endangered species Malus niedzwetzkyana for conservation biodiversity in Kazakhstan // In Vitro Cellular and Developmental Biology — Plant, 2021, Vol.57(6), P. 965–976 https://doi.org.10.1007/s11627-021-10174-4. Q2, Impact Factor 2.252, CiteScore=3.1, Percentile 70.
4. Aipova R., Abdykadyrova A., Silayev D., Tazabekova E., Oshergina I., Ten E., Kurmanbayev A. The fabrication of the complex bio-fertilizer for wheat cultivation based on collection bacteria of the pgpr group // Biodiversitas, 2020, Vol.21(11), P. 5032–5039 https://doi.org/10.13057/biodiv/d211107. CiteScore 1.3, Percentile 40.
5. Kiribayeva A., Silayev D., Abdullayeva A., Shamsiyeva Yu., Ramankulov Ye., Khassenov B. Hydrolysis of plant biomass using recombinant alpha-amylase from Bacillus licheniformis and xylanase from Bacillus sonorensis // Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2022. No. 4. P.31-39 https://doi.org/10.11134/btp.4.2022.4. РИНЦ-0,117.
6. Kiribayeva A.K., Mukanov B.A., Baduanova S.D., Silayev D.V., Ramankulov Ye.M., Khassenov B.B. Isolation and study of a recombinant carbohydrase xylanase from Bacillus licheniformis // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019. Iss.1. pp.68-72. doi:10.11134/btp.1.2019.8. РИНЦ 0,117.
7. Akishev Zh., Aktayeva S., Kiribayeva A., Abdullaeva A., Baltin K., Mussakhmetov A., Tursunbekova A., Ramankulov Ye., Khassenov B. Obtaining of Recombinant Camel Chymosin and Testing Its Milk-Clotting Activity on Cow’s, Goat’s,
   Ewes’, Camel’s and Mare’s Milk // Biology (MDPI). 2022, Vol 11, Issue 11, e1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545. Q1, Impact Factor 5.168, Cite Score 3.3, Percentile 79.
8. Akishev Zh., Kiribayeva A., Mussakhmetov A., Baltin K., Ramankulov Ye., Khassenov B. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris // Heliyon. 2021. Volume 7, Issue 5, e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137. Q2, Impact Factor 3.776, Cite Score 2.7, Percentile 75.
9. Matta E., Kiribayeva A., Khassenov B., Matkarimov B., Ishchenko A. Insight into DNA substrate specificity of PARP1-catalysed DNA poly(ADP-ribosyl)ation // Scientific Reports. 2020. Vol.10(1), 3699. pp.1-11. https://doi.org/10.1038/s41598-020-60631-0. Q1, Impact Factor 4.38, Cite Score 7.1, Percentile 93.
10. Mussakhmetov A., Shumilin I.A., Nugmanova R., Shabalin I.G., Baizhumanov T., Toibazar D., Khassenov B., Minor W., Utepbergenov D. A transient post-translational modification of active site cysteine alters binding properties of the parkinsonism protein DJ-1 // Biochemical and Biophysical Research communications. 2018. Vol.504(1). Pp. 328-333. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.08.190. Q2, Impact Factor 3.572, CiteScore 5.5, Percentile 62.
11. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov D.O, Ishchenko A.A, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori // PLoS One. 2018. Vol.13(8). e0202232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202232. Q2, Impact Factor 3.24, Cite Score 5.3, Percentile 92.

Достигнутые результаты

Осуществлен сбор образцов почвы с мест скопления пластиковых отходов: ТОО «ЭКО Полигон Астаны» и городские свалки Алматы. Полученные образцы были высеяны на твердой питательной среде с элективными агентами: Твин-20, хлорид кальция и трибутирин. Было выделено 13 изолятов, которые были скринированы на эстеразную активность. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили методом протеомного анализа MALDI-TOF BRUKER Biotyper и путем секвенирования фрагмента 16S рРНК. В результате были идентифицированы следующие штаммы: Bacillus megaterium, Yersinia intermedia, Serratia liquefaciens, Bacillus simplex, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus sonorensis, Bacillus licheniformis, Aeromonas veronii. Проведено культивирование указанных штаммов на среде с добавлением трибутирина для индукции ПЭТ-гидролитических ферментов. Проводили отделение секреторных ферментов от клеточной массы с помощью высокоскоростного центрифугирования и фильтрацией. Очистку нативных ПЭТ-гидролаз проводили путем высаливания сульфатом аммония и хроматографическим разделением. Идентификацию ПЭТ-гидролаз проводили с помощью ПААГ-ДСН в сочетании с белковой масс-спектрометрии и протеомики. На основании масс-спектрометрических данных установлено, что выделенные нативные ПЭТ-гидролазы относятся к классу эстераз с молекулярной массой от 32 до 40 кДа.

Полученные образцы ПЭТ-гидролаз были проанализированы на предмет наличия  эстэразной активности при помощи специфичных р- нитрофениловых субстратов (ацетат, бутират, октаноат). На данный момент проводится клонирование генов ПЭТ гидролаз.