Попадание пестицидов в почву происходит при непосредственном внесении их в пахотный слой или при обработке поверхности почвы в целях борьбы против почвообитающих вредителей и сорняков; высеве протравленных семян; при опрыскивании и опыливании надземных частей растений; при авиаобработках сельскохозяйственных и лесных угодий; при хранении и транспортировке пестицидов. Имеются также факты несанкционированных захоронений, устаревших и непригодных к использованию запрещенных пестицидов.

Известны различные способы восстановления нарушенных экосистем. В последнее время в экономически развитых и развивающихся странах мира все чаще прибегают к биологической очистке окружающей среды с помощью растений, которые не только сами активно участвуют в процессах фиторемедиации, но и во многих случаях благоприятно действуют на микрофлору почв, повышая эффективность процессов восстановления естественных условий. Мировой опыт показывает, что с помощью генной инженерии можно создать растения, аккумулирующие пестициды и разрушающие их до безвредного состояния. Для достижения поставленной цели проекта будут применены методы молекулярной биологии и генной инженерии растений. Планируется выбрать ген, стимулирующий накопление пестицидов и разрушающие их до безвредного состояния; создать экспрессионный вектор для доставки целевого гена в геном картофеля с помощью Agrobacterium-опосредованной трансформации; получить генетический модифицированные растения люцерны посевной, способные аккумулировать пестициды; изучить экспрессию целевого гена в условиях моделируемого загрязнения почвы пестицидами.

Актуальность

Генетически модифицированные растения способные эффективно аккумулировать и деградировать пестициды в настоящее время являются наиболее востребованным биотехнологическим продуктом. Среди способов генетической трансформации растений наиболее эффективным и надежным считается введение чужеродных генов с помощью Agrobacterium tumefaciens. При этом чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются от поколения к поколению согласно законам Менделя. Следует отметить, что это многоступенчатый трудоемкий процесс, занимающий период времени от 12 до 18 месяцев, начиная от ко-культивирования A.tumefaciens с эксплантами из семядолей или гипокотилей, продолжая индукцией и поддержанием на селективных средах нескольких сотен каллусов, завершая индукцией соматического эмбриогенеза в каждой каллусной линии и регенерацией растений.

Агробактериальная трансформация люцерны посевной (Medicago SativaL.) остается трудным и многоэтапным методом. Нерешенной проблемой, сдерживающей разработку и широкое использование технологий генетической трансформации для люцерны посевной, является существенная зависимость процесса морфогенеза in vitro от исходного генотипа и отсутствие четко регулируемых систем регенерации растений в культуре клеток и тканей.

Цель: генно-инженерное создание растений люцерны посевной (Medicago SativaL.) для повышения эффективности фиторемедиации почв, загрязненных пестицидами.

Ожидаемые результаты

• будет создана векторная конструкция, экспрессия которой в геноме растений приведет к повышению эффективности фиторемедиации почв, загрязненных пестицидами. Регенерационная компетентность районированных сортов люцерны посевной будет изучена в культуре in vitro;
• условия Agrobacterium-опосредованной трансформациилюцерны посевной будут оптимизированы с помощью репортерного гена. Трансформированные клетки будут отселектированы и особенности регенерации растений из трансформированных клеток люцерны посевной будут изучены в культуре in vitro;
• будут получены генетически модифицированных растений люцерны посевной способные эффективно аккумулировать и деградировать пестициды. Экспрессия целевого гена будет изучена в условиях моделируемого загрязнения почвы пестицидами;

Руководитель проекта

Хамзина Салтанат Рашидовна, старший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии растений РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, доктор (Ph.D) по специальности 6D060700- Биология. Область научной деятельности – молекулярная биология и биотехнология растений Индекса Хирша — 3.

Члены исследовательской группы

Манабаева Шуга Аскаровна, заведующая лабораторией генетической инженерии растений РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, кандидат биологических наук по специальности 03.00.15 – Генетика. Индекса Хирша 2.

Беккужина Сара Сабденовна, защитила докторскую диссертацию по теме «Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засухе и SeptorianodorumBerk».

Ахметоллаева Айнаш Сериковна, научный сотрудник лаборатории генетической инженерии растений РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК. Специализируется на получении трансгенных растениях, владеет методами генетической инженерии.

Абеуова Лаура Сериккызы, младший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии растений РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК. Специализируется на создание генно-инженерных конструкций для получения трансгенных растений и рекомбинантных белков в растениях, владеет методами агробактериальной трансформации.

Қали Балнұр Рахметқызы, лаборант лаборатории генетической инженерии растений РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК. Владеет методами культуры клеток и тканей, агробактериальной трансформации.

Публикации по теме проекта

1. Peterson A., Harpke D., Levichev I., Beisenova S., SchnittlerM. Morphological and molecular investigations of Gagea (Liliaceae) in southeastern Kazakhstan with special reference to putative altitudinal hybrid zones // Plant Systematics and Evolution. – 2016. – Vol. 302 (8). – P. 985-1007. IF — 1.5. https://sci-hub.tw/10.1007/s00606-016-1313-7
2. Beisenova S., Peterson A., Peterson J., Bersimbaev R. I., Klahr A., Schnittler M. On the limits of drought – Life history of Gageabulbifera (Liliaceae) // Flora- morphology, distribution, functional ecology of plants. – 2015. — Vol. 210. – P. 72-79. IF — 1.71.https://sci-hub.tw/10.1016/j.flora.2014.10.004
3. Schnittler M., Peterson A., Peterson J., Beisenova S., Bersimbaev R.I., Pfeiffer T. Minor differences with big consequences: reproductive patterns in the genus Gagea (Liliaceae) // Flora — morphology, distribution, functional ecology of plants. – 2013. – Vol. 208. – P. 591-598. IF — 1.71. https://sci-hub.tw/10.1016/j.flora.2013.09.002
4. Beisenova S. R., Bersimbaev R. I., Schnittler M. Analysis of genetic diversity of Gagea kuraminica by using method AFLP fingerprinting // Proceedings of international conference «Plant biology and biotechnology». – Almaty,2014.–P.94
5. Beisenova S. R., Bersimbaev R. I., Schnittler M. The investigation of feature of generative and vegetative reproduction of kuraminica (Liliaceae) // Proceedings of international conference «Ualikhanov readings – 18». — Kokshetau, 2014. — Vol. 5. — P.145-148
6. Бейсенова С. Р. Сравнительная характеристика репродукции двух видов рода Gagea (Liliaceae) // «Ключевые проблемы современной науки» материалы Х международной научно-практической конференции. — София, 2014. — Т.28. — С.12-15
7. Abeuova L.S., Kali B.R., Rakhimzhanova A.O., Bekkuzhina S.S., Manabayeva Sh.A. High frequency direct shoot regeneration from Kazakh commercial potato cultivars // PeerJ. –2020. Vol. 2020, Issue 7, 2020, Article number e9447. org/10.7717/peerj.9447Web of Science Q2, Corresponding author
8. Zhumabek A.T., Rakhimzhanova A.O., Bekkuzhina S.S., Ramankulov Ye.M. and Manabayeva Sh.A. Somatic embryogenesis and plant regeneration from upland switchgrass cultivars // Research on Crops. 2020, — 21, Issue 2, — P. 349-354. 10.31830/2348-7542.2020.059Web of Science Q4, Corresponding author
9. Zhumabek A.T., Abeuova L.S., Mukhametzhanov N.S., Scholthof H.B., Ramanculov Е.M., Manabayeva S.A.Transient expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein gp51 in plants by a recombinant TBSV vector //Journal of Virological Methods. 2018. – Vol. 255. – P. 1-7. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2018.01.016Web of Science Q4, Corresponding author
10. Manabayeva S.A., Shamekova M., Park J-W., Ding X.S., Nelson R.S., Hsieh Y-C., Omarov R.T., Scholthof H.B. Differential requirements for Tombusvirus coat protein and P19 in plants following leaf versus root inoculation. 2013. Virology. Volume: 439 Issue: 2 Pages: 89-96 http://dx.doi.org/10.1016/j.virol.2018.01.011.Web of Science Q3, First author
11. Gao S-J, Damaj MB, Park J-W, Beyene G, Buenrostro-Nava MT, Molina J., Wang X., Ciomperlik J. J., Manabayeva S.A., Alvarado V.Y., Rathore K.S., Scholthof H.B., Mirkov E.T. Enhanced Transgene Expression in sugarcane by co-expression of virus-encoded RNA silencing suppressors //PLoS ONE. 2013. Volume: 8. Issue: 6. Pages: 1-13 http://dx.doi:10.1371/journal.pone.0066046Web of Science Q2.
12. BekkuzhinaS, Botayeva M., Zhamekova A, Ospankulova G, Urazaliyev. Possibilities of use of Gamete Breeding for Selecting of Plants Resistant to Water Deficiency. 2016. International Journal of Advanced Engineering and Nano Technology (IJAENT) ISSN: 2347-6389, Volume-3 Issue:3. Рages: 21-25.IF 2.04http://ijaent.org/v3i3.php
13. Botayeva M.B., Zhamekova А.М., BekkuzhinaS.Using possibilities of in vitro methods for enrichment of fodder balance of alfalfa. The Way of Science International scientific journal, 2016. № 4 (26), Pages 50-54. IF 0,5 www.scienceway.ruISSN 2311-2158.
14. Абеуова Л.С., Қали Б.Р., Рахимжанова А.Ө., Беккужина С.С., Манабаева Ш.А. Особенности прямой регенерации отечественных сортов картофеля в культуре in vitro. Experimental Biology. – Алматы, 2020. – №2 (83). – С.34-41.
15. AbeuovaS., Manabayeva S.A. Establishment of CRISPR/Cas9 system with multiple guide RNAs for potato genome editing // Journal of Biotechnology. Proc. of the Europ. Biotech. Cong. – Valencia, Spain 2019. – Vol. 305S. – P. S20-21. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2019.05.082
16. Қали Б.Р., Абеуова Л.С., Рахимжанова А.Ө., Манабаева Ш.А. Картоп культурасы жасушаларының морфогенетикалық үрдістер ерекшеліктері // Молекулалық биология, биотехнология, биохимия саласындағы іргелі зерттеулер мен инновациялар: академик М.Ә. Айтхожиннің 80 жылдығына арналған жас ғалымдардың халықаралық ғылыми конференциясы материалы. – Алматы, 2019. – 68б.
17. Қали Б.Р., Абеуова Л.С., Рахимжанова А.Ө., Манабаева Ш.А. Картоп өсіндісі жасушаларының морфогенетикалық үрдістер ерекшеліктері // Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университетінің Хабаршысы / Биологиялық ғылымдар сериясы. – Нұр-Сұлтан, 2020. – №1(130).  – Б. 23-30.

Достигнутые результаты

2021 г.

В качестве целевого гена, повышающего эффективность фиторемедиации почв, загрязненных пестицидами выбран ген печени кролика cyp2E1 цитохрома Р450, проведен дизайн и синтез олигонуклеотидов для синтеза целевого гена из кДНК. Комплементарная ДНК синтезирована на матрице РНК, экстрагированной из печени кролика и создан экспрессионный вектор pSRB-CYP450 для внедрения в компетентные и способные к регенерации клеткам люцерны.

Изучены особенности каллусогенеза и морфогенеза отечественных сортов люцерны. Установлено, что эмбриогенный потенциал сортов люцерны не зависит от типов эксплантов. Отмечена максимальная частота каллусогенеза у эксплантов сорта Шортандинская 2 (93%) при культивировании на варианте среды В5К II, содержащей 2,4-Д — 5.0 мг/л, кинетин — 5.0 мг/л и НУК — 0.1 мг/л. Отмечен высокий регенерационный потенциал сорта Шортандинская 2 на среде В5P I, содержащей БАП в концентрации 0,2 мг/л. Отработан эффективный протокол регенерации побегов из семян люцерны сортов отечественной селекции для проведения работ по генетической трансформации.

2022 г.

Гетерогенные каллусы люцерны посевной использованы для Agrobacterium-опосредованной трансформации, несущие бинарную плазмиду pSRB-CYP450. Штамм AGLO выбран для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации. Выявлены оптимальные концентрации ацетосирингона (100 мкМ), суспензии бактерий (О.П.= 0,3) и времени ко-культивации каллусных клеток с бактерией (48 часов) для Agrobacterium-опосредованной трансформации каллусов люцерны посевной. С помощью мониторинга транзиентной экспрессии гена GFP выявлена низкая компетентность клеток изучаемого сорта люцерны к агробактериальной трансформации.

Публикации и охранные документы

2022 г.

Tussipkan Dilnur and Manabayeva Shuga A. Alfalfa (Medicago sativa L.): Genotypic diversity and transgenic alfalfa for phytoremediation // Frontiers in Environmental Science. – 2020, V. 12, p.1-16. doi: 10.3389/fpls.2021.747476