Оптимизация ключевых компонентов системы CRISPR/Cas9 и методов доставки этих компонентов в ядерный геном, с последующей нацеленной модификацией генов, ответственных за механизмы устойчивости к засухе у картофеля.
Геномное редактирование с использованием CRISPR/Cas9 представляет собой революционную технологию в области генетики и селекции растений. Данная технология обеспечивает точное и целенаправленное воздействие на геном, существенно сокращая временные затраты и позволяя создавать сорта с заданными характеристиками в сравнении с традиционными методами мутагенеза, которые основаны на случайных изменениях. На сегодняшний день утверждена универсальность CRISPR/Cas9, демонстрирующая его успешное применение в исследованиях устойчивости растений к засухе и создании новых сортов с улучшенной устойчивостью к данному стрессу.
В данном проекте будет изучено воздействие оптимизированных элементов CRISPR/Cas9 на специфичность Cas9 при анализе механизмов засухоустойчивости картофеля.
Проект будет реализовываться командой владеющих методами генетической инженерии растений, в том числе методами геномного редактирования, где работают специалисты области молекулярной биологии и биотехнологии растений.
Научная новизна исследований заключается в том, что планируется улучшить эффективность технологии CRISPR/Cas9 путем оптимизации ее элементов и методов доставки компонентов CRISPR/Cas9 в ядерный геном картофеля. Основной акцент будет сделан на изучении механизмов устойчивости к засухе картофеля на основе высокоурожайных отечественных сортов картофеля. Важно отметит, что не известны другие опубликованные исследования, посвященные изучению механизмов устойчивости к засухе картофеля, основанных на оптимизации элементов системы CRISPR/Cas9 и методов доставки компонентов в ядерный геном.
Фундаментальная значимость данного проекта проявляется в том, что он направлен на выявление генов, регулирующих засухоустойчивость картофеля. Результаты исследования позволят не только более глубоко понять молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости, но и предоставят ценную информацию для дальнейшего совершенствования технологий геномного редактирования в целях улучшения засухоустойчивости сельскохозяйственных культур. Эти данные могут быть ключевыми для разработки новых сортов растений и обеспечивать устойчивое сельское хозяйство.
Целью проекта является повышение эффективности технологии CRISPR/Cas9 путем оптимизации элементов системы, и методов доставки компонентов CRISPR/Cas9 в ядерный геном для изучения механизмов устойчивости к засухе картофеля.
Основным ожидаемым результатом выполнения проекта является повышение эффективности технологии CRISPR/Cas9 с помощью оптимизации элементов системы, и методов доставки компонентов CRISPR/Cas9 в ядерный геном для изучения механизмов устойчивости к засухе картофеля.
В результате выполнения проекта:
Манабаева Шуга Аскаровна. Индекса Хирша 5. https://publons.com/researcher/2449535/shuga-a-manabayeva/; ResearcherID Web of Science: A-2529-2015
2024 г.
Для поиска генов в геноме тетраплоидного картофеля негативно коррелирующих с устойчивостью к засухе были проанализированы гены-гомологи и гены-ортологи, негативно коррелирующие засухоустойчивостью по различным культурам. Выявлено, что эффективность технологии CRISPR/Cas9 для создания засухоустойчивых растений подтверждена на примере Arabidopsis с мутациями OST2, улучшающими закрытие устьиц. Нокаут генов SRL1 и SRL2 вызвал скручивание листьев, усиливая устойчивость к засухе. Анализ транскрипционных факторов, таких как NPR1 в томате, выявил их важную роль в регуляции устьиц и экспрессии генов, связанных с засухоустойчивостью. CRISPR-мутации факторов DREB2 и ERF3 в пшенице и модификация NAC071-A укрепили засухоустойчивость, а система dCas9-HAT повысила экспрессию AREB1, усиливая устойчивость риса и рапса.
В наших исследованиях для изучения механизмов засухоустойчивости картофеля с использованием оптимизированных элементов системы CRISPR/Cas9 и улучшенных методов доставки компонентов в ядерный геном был выбран микроРНК827 (MIR827), который участвует в негативной регуляции устойчивости к засухе на посттранскрипционном уровне. Нуклеотидные последовательности MIR827 (NR_127248.1) были проанализированы с помощью биоинформатических программ, таких как https://crispr.dbcls.jp/ и http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/. В исследовании изучены тринуклеотиды NGG (PAM) в MIR827, и для каждого из них была проанализирована нуклеотидная композиция 20 нуклеотидов на 5′- или 3′-конце PAM. Были выбраны три целевые последовательности как потенциальные вариабельные части направляющей РНК, которые затем клонировались к константной части направляющей РНК с использованием сайтов рестрикции BbsI. В результате получены промежуточные векторные конструкции: р203mir1, р204mir2, р205mir3.
Для редактирования MIR827 в картофеле с использованием CRISPR/Cas9 выбран бинарный экспрессионный вектор pMR284 (15 567 п.н.), в который клонировались промежуточные векторные конструкции с помощью системы Gateway. Далее, ген, кодирующий белок Cas9, был оптимизирован путем добавления сигнала ядерной локализации с использованием сайтов рестрикции AscI и клонирован под контроль промотора PcUbi РНК-полимеразы II в бинарный вектор pMR284. В результате был создан вектор, содержащий все элементы, необходимые для модификации целевых сайтов MIR827 и функционирования системы CRISPR/Cas9, а также для последующего изучения механизмов засухоустойчивости картофеля.