Актуальность

Тейлериоз является наиболее злокачественной болезнью среди всей паразитарной патологии животных. Смертность при тейлериозе достигает 40-80% от числа заболевших животных. Видовое разнообразие, распространение и процентное заражение тейлериозом крупного рогатого скота (КРС) в Казахстане остается слабо изученным вопросом. В диагностических ветеринарных лабораториях республики диагноз на тейлериоз ставится на оснований клинических признаков и микроскопических исследований мазков крови. Все вышеперечисленное приводит к отсутствию полной информации об эпизоотической ситуации по кровопаразитарным заболеваниям, включая тейлериоз в Казахстане.

Цель

Изучение эпизоотической ситуации по распространению и видовому разнообразию тейлерий в поголовье крупного рогатого скота и основных переносчиках с разработка ПЦР тест-системы для дифференциальной диагностики тейлериоза КРС.

Ожидаемые результаты

В результате выполнения проекта будет разработана ПЦР тест-система с детекцией в режиме реального времени для диагностики тейлериоза крупного рогатого скота, которая будет апробирована и внедрена в ветеринарных лабораториях для диагностики и мониторинга тейлериоза крупного рогатого скота. Получены данные о видовом разнообразии и распространении Thelaria spp. в поголовье КРС и клещах. Полученные данные эпизоотологического анализа будут использованы профильными учреждениями для мониторинга и контроля за кровопаразитарными заболеваниями. В этой ситуации, разработка ПЦР тест-системы в режиме реального времени для диагностики и видовой идентификации тейлерий, а также для изучения распространенности различных видов тейлерий среди крупного рогатого скота и клещей является актуальной задачей в национальном и международном масштабе. Новые данные о генетических характеристиках выявляемых видов тейлерий, а также их распространенности среди крупного рогатого скота и клещей в различных регионах Казахстана будут представлять практическую значимость для паразитологов и эпидемиологов всего мира.

Руководитель проекта

Муканов Касым Касенович – руководитель проекта, основными задачами являются руководство проектом, подготовка отчетов, научных статей, дизайн экспериментов, разработка ПЦР тест-системы. (68 лет). Муканов К.К. — ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0502-9238. Researcher ID: N-4118-2017), Scopus Author ID: 56340590800; доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии». Область научных интересов: Разработка диагностических тест-систем на основе ИФА, ИХА и ПЦР, изучение эпидемиологии инфекционных болезней и генетического разнообразия патогенов в Казахстане. Стаж научной работы 43 года. Автор 23 статей в зарубежных изданиях с импакт-фактором, имеет 30 охранных документов на изобретения, индекс Хирша=7 (Scopus) (ttpsh://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56340590800).

Шевцова  Елена Сергеевна — исполнитель проекта,  разработка ПЦР тест-системы, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии. (45 лет). Шевцова Е.С. — https://orcid.org/0000-0002-7221-5866 , магистр, научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Область проводимых исследований: разработка ПЦР для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза животных, кровепаразитарных заболеваний. Стаж научной работы 17 лет. Индекс Хирша (Scopus)=5, https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56736321900. Scopus Author ID: 56736321900.

Бердикулов Максат Аманбекович — исполнитель проекта, разработка ПЦР тест-системы, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методами ПЦР для выявления и видовой идентификации тейлерии.  (52 года). Бердикулов М.А. — ORCID:  https://orcid.org/0000-0003-1304-0354, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник НЦБ. Область научных интересов: эпизоотология, паразитология, разработка диагностических систем. Стаж научной работы  26 лет. Индекс Хирша (Scopus)=4. https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218251998&origin=recordpage.

Ержанова Нурдина Серик-қызы — исполнитель проекта, выделение ДНК, разработка ПЦР, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов магнитным силикогелем. Ержанова Н.С. — ORCID:  https://orcid.org/0000-0003-0612-455X. Опыт научной работы 4 года, младший научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ, магистр технических наук. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разработка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера.

Островский Александр Сергеевич — исполнитель проекта, выделение ДНК, разработка ПЦР, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов магнитным силикогелем. Островский А.С. — ORCID:
https://orcid.org/0009-0006-8139-8285. Опыт научной работы 1 год, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ, магистр. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разработка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера.

Тұрсұнбай Найля Ерлан-қызы — исполнитель проекта, выделение ДНК, разработка ПЦР, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов магнитным силикогелем. Тұрсұнбай Н.Е. — ORCID:
https://orcid.org/0000-0002-6604-4247. Опыт научной работы 1 год, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ, магистр. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разработка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера.

Даулетов Аян Ерболатович — исполнитель проекта, выделение ДНК, разработка ПЦР, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов магнитным силикогелем. (22 года). Даулетов А.Е. — ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1906-6889. Опыт научной работы 2 года, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ, PhD — докторант. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разработка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера.

Қасен Амирхан Маули-ұлы — исполнитель проекта, выделение ДНК, разработка ПЦР, исследование образцов, взятых от крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации тейлерии, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов магнитным силикогелем. Касен А.М. — ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8488-0863.  Опыт научной работы 1 год, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ, бакалавр. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разрабтка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера.

В рамках соглашения о международной коллаборации в качестве научного консультанта по данному проекту примет участие профессор Christian Bauer,  Dr. med. vet. (h-index: 30), эксперт в области эпидемиологии гемоспоридиозов животных, член European Veterinary Parasitology College.

Публикации и охранные документы научного руководителя проекта и исследовательской группы, касающиеся темы проекта

1. A.Shevtsov, E. Ramanculov, E.Shevtsova, A.Kairzhanova, P.Tarlykov, M.Filipenko, M. Dymova, G. Abisheva, A.Jailbekova, D.Kamalova, A.Chsherbakov, S. Tulegenov, A. Akhmetova, I. Sytnik, T. Karibaev, K. Mukanov.Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infection, Genetics and Evolution 34 (2015) P.173-180. doi: 10.1016/j.meegid.2015.07.008. Epub 2015 Jul 6. Web of Science Q1, IF- 2,8.Цитирование – 29.
2. Shevtsova E., Shevtsov A.,Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A, Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0167496 December 1, 2016, P.1-16. Web of Science Q1, IF-3.54. Цитирование – 23.
3. Shevtsova, E., Vergnaud, G., Shevtsov, A., Shustov, A., Berdimuratova, K., Mukanov, K., Syzdykov, M., Kuznetsov, A., Lukhnova, L., Izbanova, U., Filipenko,М., Ramankulov, Y. Genetic diversity of Brucella melitensis in Kazakhstan in relation to world-wide diversity. Frontiers in microbiology 10 (2019): 1897. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01897 Web of Science Q1. Цитирование – 19.
4. Shevtsov, A., Syzdykov, M., Kuznetsov, A., Shustov, A., Shevtsova, E., Berdimuratova, K., Mukanov, K., Ramankulov, Y. Antimicrobial susceptibility of Brucella melitensis in Kazakhstan. Antimicrobial Resistance & Infection Control 6.1 (2017): 130.  https://doi.org/10.1186/s13756-017-0293-x  Web of Science Q1. Цитирование – 19.
5. Sotnikov D.V., Berlina A.N., Zherdev A.V., Eskendirova S.Z., Mukanov K.K., Ramankulov Y.M., Mukantayev K.N., Dzantiev B.B. Comparison of Three Schemes of Quantum Dots-Based Immunochromatography for Serodiagnosis of Brucellosis in Cattle // ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences. – 2019. – Vol.14(11). – P. 3711 – 3718. 10.36478/JEASCI.2019.3711.3718. Процентиль – 44. Цитирование – 6.
6. Mukantayev, Kanatbek; Kanayev, Darkhan; Zhumabekova, Sholpan; Tursunov, Kanat; Ramankulov, Yerlan; Mukanov, Kassym. Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan// Veterinary World. – 2022. – Vol.15(8). – P.2067-2071. Scopus CiteScore 2023 – 2.0, процентиль – 44. Цитирование – 0.  
7. Nurtleu M., Adish Zh.B., Mukanov K.K., Tursunov K.A., Ramankulov E.M., Mukantayev K.N. Analysis of antibody induction by macrophages treated ex vivo with human CTLA-4, PD-L1 and PD-1 proteins in mice // Reports of Biochemistry and Molecular Biology. – 2023. – Vol.11, No4. Scopus CiteScore 2023 – 2.0, процентиль – 44. Цитирование – 0.
8. M. Kuibagarov, R. Makhamed, A. Zhylkibayev, M. Berdikulov, S. Abdrakhmanov, M. Kozhabayev, I. Akhmetollayev, K. Mukanov, A. Ryskeldina, Ye. Ramankulov, A. Shustov, Christian Bauer, A. Shevtsov. Theileria and Babesia infection in cattle – First molecular survey in Kazakhstan// Ticks and Tick-borne Diseases,Volume 14, Issue 1, January 2023, 102078. Scopus CiteScore 2023 – 6.5. Цитирование – 6.
9. Kairzhanova A.D., Manabayeva S.A., Eskendirova S.Z., Zhylkibayev A.A., Mukanov K.K., Ramanculov E.M., Shevtsov A.B. Development of PCR test systems for the diagnosis of Chlamydia in animals and birds// Journal of Biotechnology. – 2017.- Vol. 256. — European Biotechnology Congress 2017 — Dubrovnik, Croatia. 25 — 27 May 2017 – P. 44  (IF 2.599).
10. Amirgazin A., Shevtsov A., Karibayev T., Berdikulov M., Kozhakhmetova T., Syzdykova L., Ramankulov Y., Shustov A. Highly pathogenic avian influenza virus of the A/H5N8 subtype, clade 2.3.4.4b, caused outbreaks in Kazakhstan in 2020. // PeerJ. 2022 Mar 2;10:e13038. doi: 10.7717/peerj.13038. eCollection 2022. PMID: 35256921. Impact Factor: 2.984.
11. Berdimuratova K.T., Shevtsova E.S., Lutsay V.B., Izbanova U.A., Shevtsov A.B. Genetic diversity of B. melitensis strains isolated in the Zhambyl province of Kazakhstan during 2016-2019 // Herald of Science of S. Seifullin Kazakh Agro Technical University. — Vol. 112, No. 1. — 344-351. Doi: https://doi.org/10.51452/kazatu.2022.1(112).943.
12. Kuibagarov M., Kairzhanova A., Vergnaud G., Amirgazin A., Lukhnova L, Izbanova ., U., Ramankulov Y., Shevtsov A. Draft Genome Sequence of the Strain Francisella tularensis subsp. mediasiatica 240, Isolated in Kazakhstan.» Microbiology Resource Announcements 9.35 (2020). https://doi.org/10.1128/MRA.00766-20  Web of Science Q4. Цитирование – 1.
13. Amirgazin, A., Vergnaud, G., Mukanov, K., Kuibagarov, M., Karibaev, T., Ramankulov, Y., Shevtsov, A. Draft genome sequences of three Pasteurella multocida strains isolated from domestic animals in Kazakhstan. Microbiology Resource Announcements 9.32 (2020). https://doi.org/10.1128/MRA.00487-20  Web of Science Q4.Цитирование – 0.
14. Shevtsov, A., Tarlykov, P., Zholdybayeva, E., Shevtsova, E., Momynkulov, D., Sytnik, I., Karibaev, T., Chsherbakov, A., Momynaliev, K. Draft Genome Sequence of the Live Vaccine Strain Brucella abortus 82. Genome announcements, 1(6). https://doi.org/10.1128/genomeA.01101-13  Web of Science Q4. Цитирование – 5.
15. Sotnikov, D.V., Barshevskaya, L.V., Zherdev, A.V.,Eskendirova, S.Z.,Mukanov, K.K., Mukantayev, K.K., Ramankulov, Y.M., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic system for serodiagnostics of cattle brucellosis using gold nanoparticles and signal amplification with quantum dots//Applied Sciences (Switzerland). – 2020. – Vol.10 (3).  doi.org/10.3390/app10030738. Web of Science Q1. Процентиль – 50. Цитирование – 2.
16. Alexandr Shevtsov, Axel Cloeckaert, Kalysh Berdimuratova,Elena Shevtsova, Alexandr V. Shustov, Asylulan Amirgazin, Talgat Karibayev, Dinara Kamalova, Michel S. Zygmunt, Еrlan Ramanculov, Gilles Vergnaud //Brucella abortus in Kazakhstan, population structure and comparison with worldwide genetic diversity. Frontiers in Microbiology, 2023, 14, 1106994 Volume 14 — 2023 |https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1106994. Цитирование – 0.
17. Zhylkibayev A., Akishev, Zh., Khassenov B., Sarina N., Ramankulov Y., Mukanov K., Eskendirova S. Obtaining and characterization of a recombinant LipL32 protein for detection of leptospirosis //Tropical Biomedicine, 2018, Vol.35, №1, P. 280-287, https://msptm.org/files/Vol35No1/280-287-Zhylkibayev-A.pdf — Web of Science Q4, IF 0.509. Цитирование – 2.
18. Alexander Shevtsov, Pavel Tarlykov, Elena Zholdybayeva, Elena Shevtsova, Dauren Momynkulov, Igor Sytnik, Talgat Karibaev, Andrey Chsherbakov, Kuvat Momynaliev. Draft Genome Sequence of the Live Vaccine Strain Brucella abortus 82. AUTHORS INFO & AFFILIATIONS Genome Announcements, 2013, 1(6), e01101-13. DOI: https://doi.org/10.1128/genomea.01101-13. Цитирование – 6.

Достигнутые результаты

2024 г.

Проведено ПЦР исследование коллекционной выборки ДНК из цельной крови от 7000 голов крупного рогатого скота (КРС). Для обнаружения ДНК паразитов Theileria spp. использовались универсальные праймеры, нацеленные на рибосомальный оперон, что позволило проводить амплификацию ДНК различных видов тейлерий в единой реакции. Видовая идентификация Theileria spp. проведена методом секвенирования ПЦР-положительных образцов. В результате исследования 7000 образцов ДНК, вид Theileria annulata выявлен в Жамбылской (56,1%), Кызылординской (24,6%), Мангыстауской (6,3%), Алматинской (5,3%), Улытауской (0,5%) областях. Вид Theileria orientalis был выявлен в Жамбылской области 39,4%  и Туркестанской области 30,2%. К установленным видам Theileria spp. был проведен подбор праймеров и TaqMan зондов. К каждому возбудителю (Theileria orientalis и Theileria annulata) были подобраны по 2 пары праймеров и по два флуоресцентных TaqMan зонда. При подборе праймеров учитывали чтобы температура отжига праймеров была в диапазоне 58-62ºС для возможности мультиплексирвоания. При проверке в PrimerBLAST, подобранные праймеры приводят к образованию соответствующих ПЦР продуктов только с ДНК Theileria orientalis и Theileria annulata. Проведена оптимизация условий постановки ПЦР для выявления двух видов тейлерий: (Theileria orientalis и Theileria annulata). Условия постановки ПЦР были оптимизированы для 4-х пар праймеров. Оптимизацию условий проводили по температуре отжига праймеров, используя функцию градиента температур. При оптимизации использовались два образца ДНК: один образец ДНК, выделенный из цельной крови КРС с установленным носительством целевого вида тейлерий, второй образец ДНК содержал не специфичный вид тейлерий. Для оптимизации условий ПЦР с праймерами подобранными для выявления Theileria orientalis в качестве целевого образца ДНК использовали образец с установленным носительством Theileria orientalis, а в качестве второго не целевого ДНК использовали образец с установленным носительством Theileria annulata. После оптимизаций программы ПЦР циклирования была проведена оптимизация концентрации праймеров и флуоресцентного зонда в реакционной смеси. В результате проведенных исследований был оптимизирован оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации для 4-х пар праймеров.