Распространение антибиотикорезистентных штаммов бактерий становится серьезной проблемой современного здравоохранения. Наибольшее количество смертей среди бактерий вызывает возбудитель туберкулеза Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Mtb имеет множественную и широкую лекарственную устойчивость. Для возникновения мутаций в геноме патогена, необходимо понимать фундаментальные основы их возникновения, а именно процессы репликации, рекомбинации и репарации. Репликативный аппарат бактерий, за строго отведенное время, должен произвести копию геномной ДНК. Во время деления клетки происходят мутации. Такие мутации устраняются ферментами репарации ошибочно спаренных нуклеотидов. В данном проекте предлагается изучение биохимической активности ферментов репарации ДНК, принимающих участие в устранении ошибочно спаренных нуклеотидов.
На сегодняшний день, система репарации ДНК у микобактерий остается малоизученной. Несмотря на то, что при секвенировании генома M. tuberculosis, были найдены гомологи генов, кодирующих ферменты, участвующих в системе эксцизионной репарации оснований (BER), эксцизионной репарации нуклеотидов (NER), пути негомологичного соединения концов (NHEJ) и т.д., до сих пор остаются неизученными субстратная специфичность многих ферментов.
Знания, полученные в ходе экспериментов на модельном организме Escherichia coli, лежат в основе большей части исследований репарации ДНК у бактерий. Функции ряда ферментов и новых ферментов репарации, ранее необнаруженных в прокариотических клетках, а также количество путей репарации существенно различаются в случае Mycobacterium tuberculosis. Более того, геном микобактерий не содержит гомологов известных генов механизма репарации ошибочно спаренных нуклеотидов.
Целью проекта является биохимическая характеристика ранее неизученных ферментов репарации ДНК, принимающих участие в устранении ошибочно спаренных нуклеотидов.
Проблема туберкулеза как в мире, так и в Казахстане стоит очень серьезно. Распространенные линии возбудителя туберкулеза приобрели резистентность к имеющимся антибиотикам. Результаты данного проекта имеют предпосылки выявить роль ферментов репарации ДНК в возникновении антибиотикорезистентности. А также, ферменты репарации ДНК представляют собой новые перспективные мишени для разработки антибиотиков нового поколения.
Абельденов С.К. Индекс Хирша – 3; ResearcherID F-5139-2015;ORCID 0000-0002-6974-9138; Scopus Author ID 56674705400
Тургимбаева А.М. Индекс Хирша – 2; ResearcherID N-6857-2017; ORCID 0000-0001-7263-1643; Scopus Author ID 57202383621
Кириллов С.О. Индекс Хирша – 1; ResearcherID N-6322-2017; ORCID 0000-0001-6229-5762
Зейн Ұ.Ө.
2023 г.
Проведено клонирование генов ферментов репарации ДНК в экспрессирующие вектора для получения различных форм рекомбинантных белков. Проведено секвенирование полученных рекомбинантных векторов. Проведена оптимизация экспрессии рекомбинантных белков (выбор штаммов-продуцентов, подбор условий по температуре и времени культивирования биомассы, концентрации индуктора). Проведена наработка клеточной биомассы, лизис и хроматографическая очистка рекомбинантных белков с использованием различных методов хроматографии для получения рекомбинантных белков высокой чистоты очистки.
2024 г.
Были подготовлены дуплексные ДНК-субстраты, например: U-22-(5′-TAMRA-d(CACTTCGGAUTGTGACTGATCC)), 22-мер, где U=2′deoxyuridine в 10 положении, комплементарный олигонуклеотид 22-COMPL-G (5′-GGATCAGTCACAGTCCGAAGTG). Анализ расщепления дуплексных ДНК-субстратов показал наличие активности фермента в отношении субстрата, содержащего урацил в некомплементарном положении. В результате оптимизации был определен состав буфера: 25 мМ Hepes-NaOH pH 6.5, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0,1 мг/мл БСА, 0,1% Triton-X. При определении зависимости от дивалентных катионов металлов было определено, что 2,5 мМ MgCl2 в реакционной смеси способствует катализу. Реакция расщепления с использованием субстрата, содержащего урацил, показала, что максимальная активность наблюдается при использовании 1,4 мкМ концентрации фермента при использовании 20 нМ концентрации субстрата. Был определен сайт расщепления субстрата в месте расположения ошибочно спаренного основания. Было определено, что при использовании 2 мкМ концентрации бета-клампа происходит увеличение процессинга субстрата на 20-30% больше по сравнению с контролем. С помощью использования баз данных были выявлены известные аминокислотные последовательности бета-кламп мотивов белковых партнеров и проведено их сравнение для определения консервативных областей, участвующих в белок-белковых взаимодействиях. В отношении последовательности изучаемого фермента была найдена консервативная область, имеющая последовательность EYRLF.