Основной идей проекта является изучение влияния рекомбинантного интерлейкина 15 (ИЛ-15) на повышение иммунитета против лейкоза крупного рогатого скота, как в отдельности, так и совместно с анти-CTLA-4 и анти-PD-L1 антителами. ИЛ-15 увеличивает пролиферацию NK и CD8 + T-клеток и способствует усилению эффективности иммунной системы против ЛКРС. Рецепторы CTLA-4 и PD-L1 являются контрольными точками иммунной системы, увеличение которых вызывает прогрессирование хронических вирусных инфекций. В связи с этим существует гипотеза, что обработка рекомбинантным ИЛ-15, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 антителами повысит активность NK и CD8 + T-клеток и продукцию цитокинов у больных лейкозом животных.
В сложившейся ситуации с вирусным лейкозом крупного рогатого скота возникают научные и технологические нужды по разработке новых эффективных подходов лечения инфекции. Одним из перспективных молекул, предлагаемых для лечения онкологических заболеваний, является интерлейкин 15. Интерлейкин 15 увеличивает пролиферацию NK и CD8 + T-клеток и может способствовать усилению эффективности иммунной системы против лейкоза крупного рогатого скота. Вместе с антителами против CTLA-4 и PD-L1 рецепторов, интерлейкин 15 может эффективно блокировать прогрессирование хронических вирусных инфекций. В связи с этим, изучение комплексного применения интерлейкина 15, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 антител для увеличения NK и CD8 + T-клеток и концентрации цитокинов является актуальной проблемой.
Новизна проекта заключается в изучении возможности применения интерлейкина 15 в сочетании с анти-CTLA-4 и анти-PD-L1 антителами для повышения уровня клеточного иммунитета у коров зараженных ВЛКРС. Интерлейкин 15 имеет большое значение для повышения пролиферации и эффекторных функций NK-клеток, при этом не повышает концентрацию T-reg клеток. При проведении клинического испытания ИЛ-15, внутривенное введение препарата приводило к увеличению количества NK-клеток, CD56 NK-клеток и CD8 Т-клеток. Однако монотерапия препаратами ИЛ-15 оказалась неэффективной вследствие действия иммунологических контрольных точек PD-L1 и CTLA-4, а также отсутствия опухолеспецифического нацеливания NK-клеток. Комбинация анти-PD-L1 антител с ИЛ-15 оказывала двойной эффект на мышиных моделях опухолей, дополнительно усиливала противоопухолевую активность агониста PD-1. Применение ИЛ-15 в сочетании с антителами к PD-L1 и CTLA-4 в моделях карциномы значительно увеличивало выживаемость мышей.
Целью проекта является изучение совместного эффекта интерлейкина 15 и антител против CTLA-4 и PD-L1 рецепторов на повышение активности иммунитета против лейкоза крупного рогатого скота
В результате исследования будет получен штамм E.coli продуцирующий рекомбинантный ИЛ-15, отработаны протоколы выделения, очистки и ренатурации белка, получен очищенный препарат. ИЛ-15 является критическим фактором для развития и пролиферации NK и CD8 + Т-клеток памяти. Проведены исследования по изучению влияния комплексного применения ИЛ-15, анти-CTLA-4 и анти-PD-L1 антител на уровень экспрессии Bcl2, STAT3, STAT5, Cpt1a генов и IFN-γ в мононуклеарных клетках периферической крови крупного рогатого скота. Проведены исследования по изучению влияния непрерывного воздействия ИЛ-15, анти-CTLA-4 и анти-PD-L1 антител на уровень иммунологического ответа против ВЛКРС у инфицированных коров.
Мукантаев Канатбек Найзабекович, доктор биологических наук, доцент, h-индекс 4 (Author ID Scopus: 57211138932).
Турсунов К.А., PhD., старший научный сотрудник, h-индекс 3, Scopus Author ID: 57193579180; Researcher ID: N-6319-2017; ORCID: 0000-0001-8260-2563.
Әдіш Ж., PhD докторант по специальности биологии, научный сотрудник, h-индекс 2 Scopus Author ID: 57202535857; Researcher ID: AAW-7200-2020; ORCID: 0000-0001-9527-8774.
Канаев Д.Б., магистр биологии, научный сотрудник, ResearcherID: N-6950-2017; ORCID: 0000-0001-9569-9034; Author ID Scopus: 27864.
Нуртлеу М., PhD докторант по специальности биологии, младший научный сотрудник, h-индекс 1, Scopus Author ID: 57202536508; Researcher ID: N-6297-2017; ORCID: 0000-000-1299-8782.
1) Malika, N., Zhansaya, A., Kasym, M., Kanat, T., Yerlan, R., Kanatbek, M. Analysis of Antibody Induction by Macrophages Treated Ex Vivo with Human Proteins in Mice (2023) Reports of Biochemistry and Molecular Biology, 11 (4), pp. 694-701. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85153291601&partnerID=40&md5=015f2c907ce425a4b8c094005c244bf
2) Tursunov, K., Tokhtarova, L., Kanayev, D., Mustafina, R., Mukantayev, K. Effect of thioredoxin on the immunogenicity of the recombinant P32 protein of lumpy skin disease virus (2022) Veterinary World, 15 (10), pp. 2384-2390. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85140918029&doi=10.14202%2fvetworld.2022.2384-2390&partnerID=40DOI: 10.14202/vetworld.2022.2384-2390
3) Mukantayev, K., Kanayev, D., Zhumabekova, S., Shevtsov, A., Tursunov, K., Mukanov, K., Ramankulov, Y. Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan (2022) Veterinary World, 15 (8), pp. 2067-2071. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85138941681&doi=10.14202%2fvetworld.2022.2067-2071&partnerID=40DOI: 10.14202/vetworld.2022.2067-2071
4) Bulashev, A.K., Ingirbay, B.K., Mukantayev, K.N., Syzdykova, A.S. Evaluation of chimeric proteins for serological diagnosis of brucellosis in cattle (2021) Veterinary World, 14 (8), pp. 2187-2196. Цитировано 4 раз. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85116104005&doi=10.14202%2fvetworld.2021.2187-2196&partnerID=40DOI: 10.14202/vetworld.2021.2187-2196
5) Sotnikov, D.V., Barshevskaya, L.V., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Mukantayev, K.K., Ramankulov, Y.M., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic system for serodiagnostics of cattle brucellosis using gold nanoparticles and signal amplification with quantum dots (2020) Applied Sciences (Switzerland), 10 (3), статья № 738, . Цитировано 8 раз.https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85081584093&doi=10.3390%2fapp10030738&partnerID=40&md5=c18d3 DOI: 10.3390/app10030738
6) Mukantayev, K., Kairova, Z., Tursunov, K., Shustov, A., Zhumabekova, S., Ramankulov, E., Mukanov, K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis (2019) Current Topics in Peptide and Protein Research, 20, pp. 41-49. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85080894201&partnerID=40&md5=1337be9c346e87a8efb3f74e5062273
7) Sotnikov, D.V., Berlina, A.N., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Ramankulov, Y.M., Mukantayev, K.N., Dzantiev, B.B. Comparison of Three Schemes of Quantum Dots-Based Immunochromatography for Serodiagnosis of Brucellosis in Cattle (2019) ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences, 14 (11), pp. 3711-3718. Цитировано 6 раз. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85077886794&doi=10.36478%2fJEASCI.2019.3711.3718&partnerID=40&DOI: 10.36478/JEASCI.2019.3711.3718
8) Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K., Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor (2019) Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 27 (4), pp. 85-95. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85074484552&doi=10.35118%2fapjmbb.2019.027.4.10&partnerID=40&mDOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10
9) Barshevskaya, L.V., Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., Khassenov, B.B., Baltin, K.K., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Mukantayev, K.K., Dzantiev, B.B. Triple immunochromatographic system for simultaneous serodiagnosis of bovine brucellosis, tuberculosis, and leukemia (2019) Biosensors, 9 (4), статья № 115, . Цитировано 2 раз. 9) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85072779454&doi=10.3390%2fbios9040115&partnerID=40&md5=a8180DOI: 10.3390/bios9040115
10) Sotnikov, D.V., Berlina, A.N., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Ramankulov, Y.M., Mukantayev, K.N., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic serodiagnosis of brucellosis in cattle using gold nanoparticles and quantum dots (2019) International Journal of Veterinary Science, 8 (1), pp. 28-34. Цитировано 7 раз. 10) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85063189960&partnerID=40&md5=c9ba666b2eb9772380eff393ec05e6fd
11) Bulashev, A., Jakubowski, T., Mukantayev, K., Tursunov, K., Kiyan, V., Zhumalin, A. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis (2018) Medycyna Weterynaryjna, 74 (3), pp. 193-198. 11) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85045322253&doi=10.21521%2fmw.6079&partnerID=40&md5=3a572d6DOI: 10.21521/mw.6079
12) Mukantayev, K., Tursunov, K., Ingirbay, B., Adish, Z., Azhibayeva, M., Kairova, Z., Ramankulov, E., Mukanov, K., Shustov, A. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D (2018) Bulgarian Journal of Agricultural Science, 24 (3), pp. 489-496. 12) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85048693752&partnerID=40&md5=ac449c9e39df7550359671fad4b61d5
13) Mukantayev, K., Tursunov, K., Raimbek, G., Shustov, A., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K., Ramanculov, E. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51 (2018) Veterinarija ir Zootechnika, 76 (98), pp. 34-40. 13) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85047502402&partnerID=40&md5=a120bf3a11110d66b0c3e18c9402db8
14) Tursunov, K., Begaliyeva, A., Ingirbay, B., Mukanov, K., Ramanculov, E., Shustov, A., Mukantayev, K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product (2017) Iranian Journal of Veterinary Research, 18 (1), pp. 36-42. Цитировано 4 раз. 14) https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85015014330&partnerID=40&md5=4757d6d8057b200aec87f468444442
15) Zhansaya, A., Malika, N., Boris, D., Kanat, T., Kanatbek, M., Yerlan, R., Kasym, M. Expression of Recombinant CTLA-4 and PD-L1 Proteins Fused with Thioredoxin, and Determination of Their Ligand-Binding Activities (2022) Reports of Biochemistry and Molecular Biology, 11 (2), pp. 310-319. Цитировано 2 раз. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85135595075&partnerID=40&md5=5bec56ec7fd5691e7fcdda19b927a45
16) Zhansaya, A., Kanatbek, M., Kanat, T., Bakhytkali, I., Darkhan, K., Arman, K., Pavel, T., Kasym, M., Yerlan, R. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor (2020) Reports of Biochemistry and Molecular Biology, 8 (4), pp. 347-357. Цитировано 2 раз. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85104813247&partnerID=40&md5=468810d4b6680952333180ff845bdfb
17) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ15/3А — продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. Инновационный патент №25095. Мукантаев К.Н., Турсунов К., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Харлампиева Д.Д., Кущева Н.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
18) Штамм гибрид культивируемых клеток животных Mus Musculus L., продуцент моноклональных антител к ре-комбинантному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого ско-та. Авторское свиде-тельство №73446. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Белялова А.Р., Жылкибаев А.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
19) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN17 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN17. Авторское свидетельство №73335. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
20) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN47 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN47. Авторское свидетельство №73328. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
21) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN15 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN15. Авторское свидетельство №73314 1 Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
22) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TprK — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TprK. Авторское свидетельство №73307. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
23) Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/Tp0453 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum Tp0453. Авторское свидетельство №73321. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
24) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 Asia продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа Азия. Авторское свидетельство №88014. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
25) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 О продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа О. Авторское свидетельство №88019. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В.,Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
26) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 А продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа А. Авторское свидетельство №90924. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
27) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/Е3.pET22/gp51 продуцент рекомбинантного gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение №30998. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
28) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/МPRV продуцент рекомбинантного матричного белка вируса бешенства. Удостоверение автора №106743. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К,А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
29) Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К,А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
2023 г.
Проведен анализ аминокислотной последовательности белка и нуклеотидной последовательности гена интерлейкина 15 крупного рогатого скота. Для анализа использована аминокислотная последовательность, полученная из базы данных PubMed GenBank: AAA85130.1. На основе анализа литературных данных отобран активный центр цитокина длинной 166 аминокилотных остатков. На основе выбранной аминокислотной последовательности разработан кодон оптимизированный ген интерйлекина 15 крупного рогатого скота для эффективной экспрессии в кишечной палочке. На основе разработанной нуклеотидной последовательности получены 16 олигонуклеотидов длинной 60 пар. Получен фрагмент гена интерлейкина 15 крупного рогатого скота длинной 486 пар оснований путем синтеза в условиях de novo. В результате дизайна разработаны схемы генетических конструкций на основе рЕТ28 и рЕТ32 несущие ген выбранного фрагмента интерферона 15 с правильной рамкой считывания. В pET28 векторе ген интерлейкина 15 крупного рогатого скота встроен по сайтам рестрикции EcoRI и XhoI. Экспрессионный регион включает гены 6His-Tag, тромбиновый сайт, ген интерлейкина и 6His-Tag. Прогнозируемая молекулярная масса белка 24 кДа. В плазмидном векторе pET32 ген интерлейкина 15 встроен по сайтам рестрикции NcoI и XhoI. Экспрессионный регион включает гены тиоридоксинового белка, His-Tag, S-Tag, тромбина и энтерокиназы, ген интерлейкина и 6His-Tag. Прогнозируемая молекулярная масса белка 35 кДа.
В результате клонирования гена интерлейкина 15 крупного рогатого скота в рЕТ28 и рЕТ32 плазмиды получены экспрессинные плазмиды pET28/IL15bovine и рЕТ32/IL15bovine. Полученная генетическая конструкция трансформирована в электрокомпетентные клетки кишечной палочки BL21. Трансформированные клетки культивировались на твёрдой LB+kan среде при температуре 37°С. В результате получены колоний с культуральными свойствами соответствующие кишечной палочке. Для скрининга колоний были отобраны 15 колоний. Скрининг колоний клеток кишечной палочки методом полимеразной цепной реакции показал содержащие продукта длинной 486 пар оснований соответствующий размеру интерлейкина 15. Клетки отобранной колонии инокулированы в жидкую среду LB+kan и культивированы при 37°С. После центрифугирования клетки ресуспендированы в криоконсервирующей среде, аликвотированы и заморожены. Полиакриламидный гель электрофорез показал наличие продукции рекомбинантного белка с молекулярной массой 24 кДа штаммом кишечной палочки BL21/pET28/IL15bovine. Полученная генетическая конструкция рЕТ32/IL15bovine также трансформирована в кишечную палочку штамма BL21. Скрининг колоний клеток кишечной палочки методом ПЦР показал содержащие ДНК длинной 486 пар оснований соответствующий размеру гена интерлейкина 15. Клетки отобранной колонии инокулированы в жидкую среду LB+kan и культивированы при 37°С. После центрифугирования клетки ресуспендированы в криоконсервирующей среде, аликвотированы и заморожены. Полученный штамм BL21/pET32/IL15bovine продуцировал белок с молекулярной массой 35 кДа. Для определения экспрессионной активности трансформированные клетки E.coli BL21/pET28/IL15bovine и BL21/pET32/IL15bovine инкубировали в бульоне LB при различных концентрациях IPTG, температурах и времени. Оптимальные параметры экспрессии рекомбинантных белков обнаружены при 0,2 мМ, 37°С и 16-часовой индукции. Эти параметры были использованы для дальнейшего выделения и очистки рекомбинантного интерлейкина 15 крупного рогатого скота (rIL15b). Очистку rIL15b проводили с помощью Ni2+-NTA-хроматографии в условиях денатурации с помощью 8 М мочевины. Для корректного рефолдинга rIL15b осуществляли использование линейного градиента мочевины от 8 до 0 М в колонках с His-tag. Белки элюировали линейными градиентами имидазола от 20 до 500 ммоль/л.
Экспрессированные белки характеризовали с помощью 12%-ного ПААГ, иммуноблота и LC-MS/MS спектрометрии. Иммуноблот рекомбинантных белков продуцированных клетками BL21/pET28/IL15bovine и BL21/pET32/IL15bovine с моноклональными антителами против His-tag выявил полосы белка с молекулярной массой 24 и 35 кДа, соответственно. Спектральные данные ЖХ-МС/МС ионов rIL15b были проанализированы с помощью базы данных Mascot. В результате анализа спектральные ионы соответствовали интерлейкину 15 крупного рогатого скота (Scor 157,9).