Актуальность

Ежегодно инфекционные заболевания сельскохозяйственных культур приводят к значительным потерям урожая. Диагностика патогенов с помощью молекулярных методов в Казахстане не развита или сконцентрирована в отдельных крупных городах, что делает ее недоступной для фермерских хозяйств. Своевременное обнаружение фитопатогенов с помощью современных методов, таких как CRISPR/Cas системы, значительно упростят идентификацию и доступность диагностических методов, что приведет к снижению потерь урожая. Эффективные методы диагностики патогенов позволят успешно бороться с болезнями и вести селекцию, повышать урожайность сельскохозяйственных культур и обеспечивать продовольственную безопасность.

Цель

Целью Проекта является разработка технологии обнаружения фитопатогенов сельскохозяйственных культур на основе современного метода диагностики, основанного на использовании ранее неизученных Cas эффекторов Cas12a CRISPR/Cas систем. Полученные результаты расширят спектр используемых эндонуклеаз, позволяющих проводить детекцию фитопатогенов в полевых условиях, не требующих дорогостоящего оборудования, высококвалифицированного персонала и специализированных помещений.

Ожидаемые результаты

Проведен выбор генетических локусов, широко используемых для видовой идентификации грибковых фитопатогенов. Проведен отбор локусов, содержащих последовательность мотива, смежного с протоспейсером (PAM). Проведены дизайн и синтез crРНК для образования комплекса с ДНК-субстратом видоспецифичных локусов в качестве мишени обнаружения.  

Руководитель проекта

Жумакаев А. Р. Индекс Хирша: 1, ResearcherID: GZG-9689-2022,

ORCID: 0000-0001-9022-0741, Scopus Author ID: 57193544703

Члены исследовательской группы

Абельденов С. К. Индекс Хирша – 2, ResearcherID F-5139-2015,

ORCID 0000-0002-6974-9138, Scopus Author ID 56674705400

Тургимбаева А. М. Индекс Хирша: 1, ResearcherID N-6857-2017,

ORCID 0000-0001-7263-1643, Scopus Author ID 57202383621

Шайзадинова А. М. Scopus ID 57224822522, ORCID 0000-0002-5911-3064,

ResearcherID: HDM-6767-2022

Аманжолова М.Ж. Scopus ID 58509708700, ORCID 0000-0001-9847-2679,

ResearcherID: JLM-7527-2023

Публикации и охранные документы научного руководителя проекта и исследовательской группы, касающихся темы проекта

1. Zhumakayev, A.R., Varga, Vörös, Kocsubé, S., Ramteke, Szekeres, Vágvölgyi, Hatvani, Marik (2022) Characterization of the antagonistic potential of the glyphosate-tolerant Pseudomonas resinovorans SZMC 25872 strain against the plant pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens. Frontiers in Plant Science, section Plant Symbiotic Interactions. doi: 10.3389/fpls.2022.1034237
2. Allaga, H., Zhumakayev, A., Büchner., Kocsubé, Szűcs, Vágvölgyi, Kredics, Hatvani (2021) Members of the Trichoderma harzianum species complex with mushroom pathogenic potential. Agronomy, https://doi.org/10.3390/agronomy11122434
3. Zhumakayev, A. R., Vörös, Szekeres, Rakk, Vágvölgyi, Szűcs, Kredics, Škrbić, Hatvani (2021). Comprehensive characterization of stress tolerant bacteria with plant growth-promoting potential isolated from glyphosate-treated environment. World Journal of Microbiology & Biotechnology, https://doi.org/10.1007/s11274-021-03065-8

Достигнутые результаты

2023 год

Проведены амплификация и клонирование целевых последовательностей в промежуточные вектора для использования в качестве положительных контролей. Проведены дизайн и получение праймеров для амплификации целевых последовательностей с помощью изотермических методов амплификации подобранных мишеней, содержащих сайт нацеливания crРНК. Проведена оптимизация проведения изотермической амплификации локусов для наработки в качестве субстратов рибонуклеопротеинового комплекса Cas12a/crРНК.

2024 год

Были оптимизированы концентрации Cas12a,  crРНК, репортера для биохимических реакций CRISPR-Cas12a. Были выявлены оптимальные концентрации Cas12a как 100 нМ,  crРНК как 100 нМ и репортера как  5.0 мкМ. Была проведена изотермическая амплификация таргетных генов β-tubulin, Tsr1, noxB и acl1 с помощью рекомбиназной полимеразной реакции и полученные продукты были использованы для детекции Cas12a/crРНК.  Была изучена цис-активность эндонуклеазы Cas12a и установлено, что расщепление субстратов происходило в течение 5-30 минут при концентрации Cas12a 200 нМ и выше. Была проведена оценка транс-расщепляющей активности эндонуклеазы Cas12a по отношению к ssDNA (FAM-reporter-5-BHQ-1, TTATT). Транс-активность была выявлена в течение 20-30 минут инкубации при температуре 37 °С. Было изучена оценка обнаружения субстрата Cas12a с помощью иммунохроматографических тестов используя FAM-reporter-10-LFA (TTATT).