Альфа-амилаза является ферментом, который катализирует разрыв α-1,4-глюкозидных связей в крахмале с образованием низкомолекулярных олигосахаридов и небольшого количества мальтозы и глюкозы. В технологиях переработки крахмала α-амилаза является основным ферментом, осуществляющим гидролиз сырья. Бактериальная α-амилаза из Bacillus licheniformis является перспективным объектом для научного изучения и практического использования. В лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов НЦБ сформирована коллекция бактерий рода Bacillus, собранных из различных регионов Казахстана. Идея проекта заключается в получении и изучении α-амилазы из Bacillus licheniformis T5. Будет проведена экспрессия гена в дрожжах, изучены биохимические характеристики, подобраны условия для ферментации в биореакторе, выделения и очистки фермента.

Актуальность

Проект посвящен получению α-амилазы из штамма B.licheniformis Т5. В лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов на протяжении нескольких лет проводилась работа по выделению, идентификации и изучению характеристик бактерий рода Bacillus из образцов почвы различных регионов Казахстана. Исследовалась протеолитическая, ксилолитическая и амилолитическая активности выделенных штаммов. В частности, была проведена работа по скринингу изолятов B.licheniformis на амилазную активность и были отобраны штаммы, секретирующие α-амилазу. Секвенирование гена α-амилазы показало, что для казахстанских штаммов характерен полиморфизм в данном локусе, который коррелирует с амилазной активностью. Представляется интересным с научной точки зрения и перспективным с практической изучение α-амилазы штамма B.licheniformis Т5, выделенного из почвы Южного Казахстана и обладающего максимальной амилазной активностью среди других штаммов. В рамках проекта будет проведена экспрессия гена α-амилазы из B.licheniformis Т5 в дрожжах P.pastoris, выделен и получен фермент, определены биохимические показатели (рН и температурный оптимумы, температурная и рН- стабильность, время полужизни при разных температурах, зависимость от ионов металлов, влияние ингибиторов на активность фермента), культивирование штамма-продуцента в пилотном и полупромышленном ферментере, получение сухой формы α-амилазы. 

Научная новизна проекта заключается в том, что будет получена и изучена α-амилаза из казахстанского штамма B.licheniformis Т5. Практическая значимость проекта заключается в получении термостабильного фермента для применения в технологиях гидролиза крахмалсодержащего сырья. Социально-экономический эффект от результатов проекта заключается в выпуске биопрепарата для перерабатывающей промышленности.

Цель

Изучении биохимических свойств α-амилазы из казахстанского штамма Bacillus licheniformis T5 полученной в дрожжах.

Ожидаемые результаты

В результате проведенных исследований будет получена термостабильная α-амилаза изказахстанского штамма Bacillus licheniformis T5, определены ее биохимические характеристики, определены температурные и рН показатели стабильности фермента, изучено влияние ингибиторов на активность фермента, оценена возможность культивирования штамма-продуцента в условиях глубинной ферментации в биореакторах.

Область применения ожидаемого результата – биотехнология. Целевыми потребителями ожидаемого результата являются биотехнологические компании и предприятия задействованные в переработке крахмалсодержащего сырья.

Полученные в ходе реализации проекта результаты будут способствовать развитию отечественной биотехнологической науки.

Полученные результаты положительным образом повлияют на развитие основного научного направления – молекулярная биотехнология, технология глубокой переработки крахмалсодержащего сырья.

Социально-экономический эффект заключается в подготовке научных кадров, так как в проекте задействованы молодые специалисты, готовящиеся к защите своей PhD-работы, и результаты проекта будут использованы при подготовке 1PhD-диссертации.

Руководитель проекта

Силаев Дмитрий (http://orсid.org/0000-0001-6867-953X; ResearcherID: AAQ-8940-2020), руководитель проекта, старший научный сотрудник лаборатории генетики и биохимии микроорганизмов, кандидат наук.

Члены исследовательской группы

Бердыгулова Ж.А. (ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0379-2472. Scopus ID: 23977664200. WoS ID: I-2943-2018.) – PhD-докторант (биотехнология), специалист в области молекулярной биологии и биотехнологии, научный сотрудник. Индекс Хирша: 4. Суммарно – 86 цитирований. Бердыгулова Ж. будет проводить работы по наработке и очистке α-амилазы, оптимизации условий для получения α-амилазы.

Сарсен Арайлым (https://orcid.org/0000-0002-6071-430X), исполнитель, лаборант, окончила ЕНУ, обучается в магистратуре, 22 года, 1 год научного стажа (молекулярная биология). Сарсен А. будет задействована в работах по клонированию гена α-амилазы, сборке генно-инженерной конструкции и получению штамма-продуцента α-амилазы.

Публикации и охранные документы по теме проекта:

1. Aipova R., Abdykadyrova A., Silayev, Tazabekova E., Oshergina I., Kermanbayev A. The fabrication of the complex bio-fertilizer for wheat cultivation based on collection bacteria of the PGPR group // Biodiversitas. 2020. Vol.21.(11). pp. 5032-5039doi: 10.13057/biodiv/d211107 (Q3, IF-0.88, Процентиль-38, CS-1.2).
2. Kiribayeva A.K., SilayevV., Baduanova S.D., Khassenov B.B. Enrichment of grain hydrolysate with bacterial protein // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019. Iss.1. pp.85-89. DOI: 10.11134/btp.1.2019.10 (РИНЦ 0.09)
3. Kiribayeva A.K., Mukanov B.A., Baduanova S.D., SilayevV., Ramankulov Ye.M., Khassenov B.B. Isolation and study of a recombinant carbohydrase xylanase from Bacillus licheniformis // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019. Iss.2. pp.68-72. DOI: 10.11134/btp.1.2019.8 (РИНЦ 0.09)
4. Kirillov S., Silaev, Abeldenov S., Khassenov B. Heterologous extracellular expression of bacterial phytase (AppA) in Pichia pastoris and its biochemical characterization // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. — 2016. — Iss.4. — pp. 36-44. DOI: 10.11134/btp.4.2016.5.
5. Sarsen, Saginova M., Mukanov B., Aktayeva S., Akishev Zh., Mussakhmetov A., Kiribayeva A., Baltin K., Silayev D., Khassenov B. Genetic engineering materials bank of the National center for biotechnology // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. -2020. №2. -P.91. (РИНЦ-0,090).
6. Калимкулова М., Кирибаева А., Мухамедьяров Д., Куламетов Ж., Ахметоллаев И., Силаев Д., Хасенов Б. Получение рекомбинантной α-амилазы Amy1UA7 из subtilis в клетках E.coli // Биотехнология. Теория и практика №4, 2015, С.57-65.
7. Калимкулова М.C., Кирибаева А.К., Силаев Д.В., Хасенов Б.Б. Биохимические параметры рекомбинантной α-амилазы Amy1UA7 // Наука, Биологические науки, 2016, № 4-1, С. 116-119.
8. Балтин К.К., Кирибаева А.К., Силаев Д.В., Хасенов Б.Б Получение рекомбинантной β-галактозидазы из Lactobacillusplantarum // Наука. Специальный выпуск — Биологические науки. 2016. №4-1. c.31-34.
9. Abeldenov S., Kirillov S., Kiribayeva A., Silayev Khassenov B. Expression, purification and biochemical characterization of recombinant phosphohydrolase AppA in Escherichia coli // Biotechnology. Theory and Practice. 2014. №3. pp.61-65.
10. Baltin K.K., Akishev Zh.D., Abeldenov S.K., SilayevV., Khassenov B.B. Biochemical properties of recombinant β-galactosidase from Streptococcus thermophilus // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. — 2017. — N.2. – pp. 68-73. DOI: 10.11134/btp.2.2017.11.
11. Kirillov S., Silayev, Abeldenov S., Ramankulov Ye., Khassenov B. Small scale industrial production of bacterial phytase AppA // International Symposium “Astana Biotech 2018”. Astana. 2018. P.94.
12. Kiseleva I.V., Voeten J.T.M., Teley L.C.P., Larionova N.V., Dubrovina I.A., Berdygulova Z.A., et al. Genome Composition Analysis of Reassortant Influenza Viruses Used in Seasonal and Pandemic Live Attenuated Influenza Vaccine. 2011;26(4):174-185. IF 0.25; Q4.
13. Berdygulova, Esyunina D., Miropolskaya N., Mukhamedyarov D., Kuznedelov K., Nickels B., Severinov K., Kulbachinskiy A., Minakhin L. A novel phage-encoded transcription antiterminator acts by suppressing bacterial RNA polymerase pausing. Nucleic Acids Research. 2012;40(9):4052-4063. https://doi.org/10.1093/nar/gkr1285. IF 11.501; Q1.
14. Berdygulova Z, Westblade LF, Florens L, Koonin EV, Chait BT, Ramanculov E, Washburn MP, Darst SA, Severinov K, Minakhin L.. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus J.Mol.Biol. 2011;405(1):125-142. IF 4.76; Q1. DOI: 10.1016/j.jmb.2010.10.049
15. Ramanculov E.,, Florens L., Glazko G., Karamychev V, Slesarev A., Kozyavkin A., Khromov I., Ackermann H., Washburn M., Mushegian A., Severinov K. Genome Comparison and Proteomic Characterization of Thermus thermophilus Bacteriophages P23-45 and P74-26: Siphoviruses with Triplex-forming Sequences and the Longest Known Tails. J.Mol.Biol. 2008;378(2):468-480. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.02.018. IF 4.76; Q1.
16. Ostapchuk Y.O., Zhigailov A.V., Perfilyeva Y.V., Shumilina A.G., Yeraliyeva L.T., Nizkorodova A.S., Kuznetsova T.V., Iskakova F.A., Berdygulova Z.A., Neupokoyeva A.S., Mamadaliyev S.M., Dmitrovskiy A.M. Two case reports of neuroinvasive West Nile Virus infection in the Almaty region, Kazakhstan. IDCases. 2020;21:e00872. https://doi.org/10.1016/j.idcr.2020.e00872. SJR 0.294.
17. Кириллов С., Абельденов С., Силаев Д., Хасенов Б. Рекомбинантный штамм Pichia pastorisX-33/appa, продуцирующий бактериальную фитазуAppA // Патент Республики Казахстан №32368 от 16.08.2017.
18. Абельденов С.К., Силаев Д.В., Кириллов С.О., Кирибаева А.К., Раманкулов Е.М., Хасенов Б.Б. Рекомбинантный штамм Escherichia coliArctic Express(DE3)RP/pAppA, продуцирующий фосфогидролазуАррА» // Патент РК №30999 от 19.02.2016.
19. Абельденов С.К., Бердыгулова Ж.А., Силаев Д.В., Раманкулов Е.М., Хасенов Б.Б. Способ получения термостабильной ДНК полимеразы бактерии Thermus aquaticus Taq-Pol с помощью рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pTPm // Патент Республики Казахстан №29152 от 20.10.2014.

Достигнутые результаты

2021 год

• из почвы выделены и идентифицированы штаммы Bacillus sp.А5.3, Bacillus sp.А5.5, Bacillus sp.А7.1, Bacillus sp.А11.2, Bacillus sp.T5, которые были исследованы на α-амилазную активность;
• с использованием белковой масс-спектрометрии и протеомики в секреторной протеоме штамма Bacillus sp.T5 идентифицирована α-амилаза 58,4 кДа;
• из геномной ДНК штаммов Bacillus sp.А5.3 и Bacillus sp.T5 выделены, клонированы и секвенированы гены α-амилаз amyA5.3 и amyТ5, протяженностью 1980 п.о. и 1539 п.о., соответственно.
• нуклеотидная последовательность генов amyA5.3 и amyТ5 из штаммов Bacillus sp.А5.3 и Bacillus sp.T5 депонированы в базе данных GenBank за номерами MW276066 и submission ID 2512515, соответственно;
• на основании данных по нуклеотидной последовательности генов amyA5.3 и amyТ5, филогенетического анализа и данных масс-спектрометрического анализа штаммы отнесены к Bacillus sp.А5.3 и Bacillus sp.T5 к Bacillus velesensis и Bacillus lichenifromis, соответственно;
• ген α-амилазы amyТ5 из штамма Bacillus lichenifromis T5 успешно клонирован и экспрессирован в дрожжах Pichia pastoris X-33;
• сочетанием N-дегликозилирования и вестерн-блотинга с использованием поликлональных анти-rAmyТ5 антител показано, что дрожжевой штамм P.pastoris X-33_pPICZα/AmyТ5 секретирует гликозилированную α-амилазу с молекулярной массой 68 кДа и активностью 36 Ед/мл;
• определен рН и температурный оптимум для гликозилированной α-амилазы rAmyТ5, который составляет 6,5 и 80°С, соответственно;

Публикации и охранные документы

Aktayeva S., Baltin K., Kiribayeva A., Akishev Zh., Silayev D., Ramankulov Ye., Khassenov B. Isolation of Bacillus sp. A5.3 Strain with Keratinolytic Activity// BIOLOGY-BASEL. -2022. Vol.11. Issue2. Impact Factor — 5.079, Квартиль – Q1. DOI 10.3390/biology11020244