В проекте продемонстрирована технология получения моноклональных антител, в которой на этапе иммунизации животных вместо традиционых белковых антигенов используются иммуногены в форме нуклеиновых кислот, причём для получения сильного и сконцентрированного иммунного ответа применяется гетерологическая прайм-буст иммунизация. Идея проекта: гетерологическая иммунизация с использованием комбинации векторов разного типа – автономно реплицирующейся РНК и ДНК-вакцины — предоставляет технологически совершенный способ индукции гуморального ответа против антигенов, которые сложно произвести и применить в форме очищенных белков. Для демонстрации эффективности проектной технологии будут получены моноклональные антитела против антигенов с высокой практической важностью – белка шипа (S) коронавируса SARS-CoV-2 и гликопротеина стельности коров PAG1.

Актуальность

В условиях развертывающейся эпидемии COVID-19 колоссальное значение для медицины имеет поиск терапевтических препаратов, эффективных против SARS-CoV-2, как и другие исследования иммунологии коронавируной инфекции. В качестве терапевтического препарата потенциально возможно использовать хьюманизированные вирус-нейтрализующие MAb против белка S SARS-CoV-2 (иммунодоминантный вирусный антиген, белок ответственный за связывание вирусной частицы с клеточным рецептором) [64,65]. В данном проекте будут получены MAb против белка S SARS-CoV-2, и гибридомы, которые можно использовать для создания хьюманизированных антител.

Новизна

В РК не проводятся работы по созданию репликонных конструкций, за исключением работ заявителей. В мировой науке ситуация следующая: применение альтернативных подходов к иммунизации является “горячей точкой” экспериментальной иммунологии. Проект обладает новизной: остаётся широкое пространство для поиска оптимальных решений в выборе векторов и режимов гетерологической иммунизации. Заявители впервые продемонстрируют эффективность комбинации псевдоинфекционных вирусов и ДНК-вакцин для получения моноклональных антител.

Значимость проекта. Гетерологическую иммунизацию можно использовать для создания вакцин против актуальных патогенов, как успешно продемонстрировали российские разработчики на примере вакцины “СПУТНИК V”. Фактически, в проекте будет создан прототип вакцины против SARS-CoV-2. Проект создаёт предпосылки для создания в РК вакцин против COVID-19. Успех проекта сигнализирует подъём биотехнологии в РК на более высокий уровень.

Цель

Продемонстрировать эффективность прайм-буст иммунизации псевдоинфекционными вирусами и плазмидными ДНК в качестве альтернативы иммунизации белковыми антигенами в процессе производства моноклональных антител против белка S коронавируса SARS-CoV-2 и гликопротеина стельности коров PAG1.

Ожидаемые результаты

Генно-инженерные конструкции для индукции гуморального иммунного ответа против главного антигена коронавируса SARS-CoV-2; генно-инженерные конструкции для получения рекомбинантного белка PAG1 (маркёр стельности коров), и для индукции антител против PAG1 (используются в диагностике в животноводстве); моноклональные антитела против белка S коронавируса SARS-CoV-2; моноклональные антитела против белка PAG1; технология иммунизации без использования очищенных белков для получения моноклональных антител; метод измерения титров антител против коронавируса SARS-CoV-2, пригодный для применения в медицине и эпидемиологии; публикация в международном журнале с импакт-фактором.

Влияние ожидаемых результатов на развитие науки и технологий: Проект обладает научной новизной, по причине использования протокола иммунизации, объединяющего псевдовирусы (РНК-репликоны) и ДНК-вакцины, это новое направление в иммунизации (НК-иммунизация). Область запланированных исследований в настоящее время являются горячей точкой на стыке генетической инженерии и иммунологии. Гетерологическую иммунизацию можно использовать для создания эффективных вакцин против актуальных патогенов, примером замечательного успеха гетерологической иммунизации в вакцинологии является российская вакцина против COVID-19 “СПУТНИК V”. Для генетической инженерии и иммунологии РК работы по проекту являются инновационными исследованиями, и успех проекта доказывает подъём биотехнологии в стране на более высокий технологический уровень.

Руководитель проекта

Шустов Александр Вячеславович, кандидат биологических наук, руководитель проекта, заведующий лабораторией генетической инженерии РГП «Национальный центр биотехнологии». Научные интересы: молекулярная биология, генетическая инженерия, технологии производства биотехнологических продуктов с использованием рекомбинантных ДНК, неклиническая иммунология, вакцинология, рекомбинантные и хъюманизированные антитела. Индекс Хирша — 7.

https://orcid.org/0000-0001-9880-9382

Scopus Author ID: 7003352587

ResearcherID: K-1148-2013

Члены исследовательской группы

Куйбагаров Марат Амангельдыевич, кандидат ветеринарных наук, h-индекс-1. Стаж научных исследований 17 лет. Специалист по производству моноклональных антител. Роль в проекте – проводит иммунизации мышей,получает гибридомы, нарабатывает моноклональные антитела.

Исполнитель – Кеер Виктория Владимировна, магистр биологии, индекс Хирша 2, младший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии НЦБ. Роль в проекте – собирает инфекционные клоны репликонов, производит и титруетPIV.

Исполнитель – Сыздыкова Лаура Ризабековна, магистр техники и технологии, индекс Хирша 1 (Thomson Reuters) H:2 (РИНЦ), младший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии НЦБ. Роль в проекте – собирает генно-инженерные конструкции, плазмиды,исследует иммунные сыворотки в ИФА.

Исполнитель – Зауатбаева Гульзат Маратовна. Магистр технических наук со специализацией биотехнология, младший научный сотрудник лаборатории генетической инженерии НЦБ. Роль в проекте – поддерживает банк клеточных культур, выделяет плазмиды, проводит клонирования.

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. Keyer V.V., Shevtsov A.B., Zaripov M.M., Baltabekova A., Ramanculov E.M., Shustov A.V. Towards Development of Plasmacytoma Cells-Based Expression Systems Utilizing Alphavirus Vectors: An NS0-VEE Model. J Virol Methods. 2019 Dec;274:113734. doi: 10.1016/j.jviromet.2019.113734. Epub 2019 Sep 13. PMID: 31525396 (IF-1.746, Q3)
2. Axambayeva A.S., Zhaparova (Syzdykova) L.R., Shagyrova Zh.S., Ramankulov E.M., Shustov A.V. Unusual Stability of a Recombinant Verrucomicrobium spinosum Tyrosinase to Denaturing Agents and Its Use for a Production of a Protein with Adhesive Properties. Appl Biochem Biotechnol. 2018 Jul;185(3):736-754. doi: 10.1007/s12010-017-2686-y. Epub 2018 Jan 6. PMID: 29306981 (IF-2.220, Q2)
3. Kalendar R., Shustov A.V., Seppдnen M.M., Schulman A.H., Stoddard F.L. Palindromic sequence-targeted (PST) PCR: a rapid and efficient method for high-throughput gene characterization and genome walking. Sci Rep. 2019 Nov 27;9(1):17707. doi: 10.1038/s41598-019-54168-0. PMID: 31776407 (IF-4.011, Q1)
4. Kim Yu.G., Baltabekova A.Zh., Zhiyenbay E.E., Aksambayeva A.S., Shagyrova Zh.S., Khannanov R., Ramanculov E.M., Shustov A.V. Recombinant Vaccinia virus-coded interferon inhibitor B18R: Expression, refolding and a use in a mammalian expression system with a RNA-vector. PLoS One. 2017 Dec 7;12(12):e0189308. doi: 10.1371/journal.pone.0189308. eCollection 2017. PMID: 29216299 (IF-2.776, Q1)
5. Baltabekova A.Zh., Shagyrova Zh.S., Kamzina A.S., Voykov M., Zhiyenbay Y., Ramanculov EM, Shustov A.V. SplitCore Technology Allows Efficient Production of Virus-Like Particles Presenting a Receptor-Contacting Epitope of Human IgE. Mol Biotechnol. 2015 Aug;57(8):746-55. doi: 10.1007/s12033-015-9867-0. PMID: 25837568 (IF-1.751, Q2)
6. Manat Y., Shustov A.V., Evtehova E., Eskendirova S.Z. Expression, purification and immunochemical characterization of recombinant OMP28 protein of Brucella species. Open Vet J. 2016;6(2):71-7. doi: 10.4314/ovj.v6i2.1. Epub 2016 May 20. PMID: 27303654 (IF-0.54, Q2)
7. Shustov A.V., Mason P.W., Frolov I. Production of pseudoinfectious yellow fever virus with a two-component genome. J Virol. 2007 Nov;81(21):11737-48. doi: 10.1128/JVI.01112-07. Epub 2007 Aug 22. PMID: 17715227 (IF-4.324, Q1)
8. Niall J. Foy, Maryna Akhrymuk, Alexander V. Shustov, Elena I. Frolova, and Ilya Frolov Hypervariable domain of nonstructural protein nsP3 of Venezuelan equine encephalitis virus determines cell-specific mode of virus replication. J Virol. 2013 Jul;87(13):7569-84. doi: 10.1128/JVI.00720-13. Epub 2013 May 1. PMID: 23637407 (IF-4.324, Q1)
9. McGee C.E., Shustov A.V., Tsetsarkin K., Frolov I.V., Mason P.W., Vanlandingham D.L., Higgs S. Infection, dissemination, and transmission of a West Nile virus green fluorescent protein infectious clone by Culex pipiens quinquefasciatus mosquitoes. Vector Borne Zoonotic Dis. 2010 Apr;10(3):267-74. doi: 10.1089/vbz.2009.0067. PMID: 19619041 (IF-2.041, Q2)
10. Shustov A.V., Frolov I. Efficient, trans-complementing packaging systems for chimeric, pseudoinfectious dengue 2/yellow fever viruses. Virology. 2010 Apr 25;400(1):8-17. doi: 10.1016/j.virol.2009.12.015. PMID: 20137799 (IF-2.657, Q2)
11. Международный патент и патент США: (WO/2008/137163) TWO-COMPONENT GENOME FLAVIVIRUS AND USES THEREOF. Inventors: Ilya V. Frolov and Alexandr V. Shustov. Houston TX US.Pub. No.: WO/2008/137163 International Application No.: PCT/US2008/005824. Patent application number: 20090324623.
12. 1Kuibagarov M, Amirgazin A, Vergnaud G, Shustov A, Ryskeldina A, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequence of Moraxella bovoculi strain KZ-1, isolated from cattle in North Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00670-20. https://doi.org/10.1128/MRA.00670-20
13. Kuibagarov M, Kairzhanova A, Vergnaud G, Amirgazin A, Lukhnova L, Izbanova U, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequence of the strain Francisella tularensis subsp. mediasiatica 240, isolated in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00766-20. https://doi.org/10.1128/MRA.00766-20
14. Amirgazin A, Vergnaud G, Mukanov K, Kuibagarov M, Karibaev T, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequences of three Pasteurella multocida strains isolated from domestic animals in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00487-20. https://doi.org/10.1128/MRA.00487-20.
15. Keyer V.V., Shevtsov A.B., Zaripov M.M., Baltabekova A.Z., Ramanculov E.M., Shustov A.V. Towards development of plasmacytoma cells-based expression systems utilizing alphavirus vectors: An NS0-VEE model. J Virol Methods. 2019 Dec;274:113734. PMID: 31525396. IF-1,746.
16. Axambayeva A.S., Zhaparova (Syzdykova) L.R., Shagyrova Zh.S., Ramankulov E.M., Shustov A.V. Unusual Stability of a Recombinant Verrucomicrobium spinosum Tyrosinase to Denaturing Agents and Its Use for a Production of a Protein with Adhesive Properties. Appl Biochem Biotechnol. 2018 Jul;185(3):736-754. Epub 2018 Jan 6. IF-1,429
17. Keyer V.V., Baltabekova A.Zh., Mahatova A.S., Shustov A.V. Venezuelan equine encephalitis virus capable of non-cytopathic replication: virus production and growth in cells with varying degrees of resistance to infection. Eurasian Journal of Applied Biotechnology.- 2018, Vol.1. 10.11134/btp.1.2018.5 IF-0,117
18. Keyer V.V., Shevtsov A.B., Kassymkhanova A.S., Baltabekova A.Zh., Shustov A.V. Recombinant yellow fever virus which expresses heterologous protein during replication. Eurasian Journal of Applied Biotechnology.-2018, 10.11134/btp.2.2018.7 IF-0,117

Достигнутые результаты

2021 год

В данном исследовании впервые в Казахстане продемонстрирована эффективность технологии гетерологической прайм-буст иммунизации вирусами и плазмидными ДНК в качестве альтернативы иммунизации белковыми антигенами в процессе производства моноклональных антител. Созданы рекомбинантные вирусы, производящие поверхностный гликопротеин S коронавируса SARS-CoV-2 и гликопротеин стельности коров PAG1. Созданы плазмидные векторы для экспрессии in vivo белков S и PAG1. Получены моноклональные антитела против антигенов S и PAG1.

Публикации и охранные документы

Amirgazin A, Shevtsov A, Karibayev T, Berdikulov M, Kozhakhmetova T, Syzdykova L, Ramankulov Y, Shustov AV. Highly pathogenic avian influenza virus of the A/H5N8 subtype, clade 2.3.4.4b, caused outbreaks in Kazakhstan in 2020 //PeerJ. 2022 Mar 2;10:e13038. doi:10.7717/peerj.13038. eCollection 2022 . Q2