Идея проекта заключается в получении рекомбинантных антигенов RBD и S коронавируса SARS-CoV-2 и разработке ИФА тест-системы на основе RBD или S. Антигены RBD и S будут тестированы в ИФА на сыворотках людей с COVID-19, и по результатам будет выбран наиболее оптимальный антиген. В рамках проекта будет получен рекомбинантный конъюгат SpA/SpG-HRP, представляющий собой фьюжен белок, состоящий из иммуноглобулин связывающих доменов белков SpA и SpG бактерий Staphylococcusaureus и Streptococcussp. и пероксидазы хрена HRP. Использование конъюгата позволит проводить детекцию иммуноглобуллинов в ИФА и иммуноблотинге без применения антивидовых антител.

Актуальность

Самой серьезной проблемой, с которой столкнулось человечество в 2020 году является пандемия атипичной пневмонии COVID-19, вызванная представителем семейства одноцепочечных положительных РНК вирусов – SARS-CoV-2. Атипичная пневмония COVID-19 возникает при заражении человека SARS-CoV-2 и чаще всего протекает с классическими признаками ОРВИ, но в ряде случаев заболевание протекает бессимптомно. После попадания вируса в организм иммунная система человека начинает вырабатывать специфические антитела, выявление которых является информативным свидетельством текущего или бывшего в прошлом инфекционного процесса. Для серологического тестирования по выявлению в сыворотке крови специфических антител используют метод иммуноферментного анализа (ИФА), который для удобства реализован в виде готового набора. Ключевыми компонентами набора являются антиген, который должен обладать высокой специфичностью и чувствительностью к антителам и конъюгат, обеспечивающий детекцию результата. Практическая значимость проекта заключается в разработке ИФА тест-системы и получении готового ИФА набора для выявления в сыворотке людей антитела против коронавируса SARS-CoV-2. Разрабатываемая тест-система имеет диагностическую и эпидемиологическую ценность для мониторинга лиц, переболевших коронавирусом и для проведения эпиднадзора за SARS-CoV-2.

Цель

Разработка ИФА тест-системы для диагностирования инфекционного возбудителя атипичной пневмонии COVID-19 на основе рекомбинантных гликозилированных антигенов RBD и S коронавируса SARS-CoV-2.

Ожидаемые результаты

В результате проведенных исследований будет получено 2 рекомбинантных антигена коронавирусаSARS-CoV-2: S и RBD, рекомбинантный конъюгатSpA/SpG-HRP, способный заменить антитела anti-Human в серологической диагностике, ИФА тест-система на одном из наиболее оптимальном антигене для выявления в сыворотке крови человека антитела против коронавируса SARS-CoV-2. Разработанная ИФА тест-система обеспечит надежное и точное обнаружение антител у болеющих или переболевших атипичной пневмонией COVID-19. Удобный формат ИФА тест-системы, высокая чувствительность и специфичность за счет высокооочищенного антигена и конъюгатаSpA/SpG-HRP позволит использовать ее для диагностики вновь заболевших коронавирусом, для мониторинга лиц переболевших коронавирусом и для проведения эпиднадзора за SARS-CoV-2. Набор по ИФА тест-системе будет содержать: планшет с иммобилизованным антигеном (S или RBD), отмывочный раствор, конъюгатSpA/SpG-HRP, хромоген ТБМ, останавливающий реагент (стоп-реагент), положительный и отрицательные контроли в виде инактивированных сывороток, инструкция для проведения диагностики.

В рамках проекта будет проведены все тесты, подтверждающие соответствие полученных рекомбинантных белков (S или RBD, конъюгатSpA/SpG-HRP) требуемым характеристикам. Полученные антигены, конъюгат и протоколы по их использованию будут применены на практике в Алматинском филиале Национального центра биотехнологии на образцах биоматериала от людей с подтвержденным диагнозом атипичная пневмония COVID-19, вызванная коронавирусомSARS-CoV-2.

Практическая направленность проекта ориентирована на применение разработанной ИФА тест-системы в диагностических лабораториях с целью идентификации возбудителя атипичной пневмонии COVID-19 на сыворотках людей. Полученные в ходе реализации проекта результаты будут способствовать развитию отечественных биотехнологических производств и применению наукоемких технологий в производстве изделий медико-диагностического назначения. Разработанная ИФА тест-система по выявлению антител в сыворотках крови людей, болеющих или переболевших COVID-19 имеет перспективу коммерциализации.

Руководитель проекта

Балтин Кайрат (Scopus Author ID: 55437315200; ORCID: http://orсid.org/0000-0002-6187-7223; Researcher ID: AAQ-9372-2020).

Члены исследовательской группы

Хасенов Бекболат (Scopus Author ID: 36096620800; ORCID: http://orсid.org/0000-0003-4572-948X; Researcher ID: AAM-8657-2020).

Кирибаева Асель (ScopusAuthorID: 57215499873; http://orсid.org/0000-0002-8293-2340; Researcher ID: N-6774-2017).

Акишев Жигер (Scopus 56674741700 http://orсid.org/0000-0001-9943-1625; Researcher ID: N-6206-2017).

Мусахметов Арман (Scopus Author ID: 57203751227; http://orсid.org/0000-0002-6182-3487; Researcher ID: AAQ-9945-2020).

Актаева Сания (http://orсid.org/0000-0001-6346-5866; Researcher ID: AAR-5133-2020).

Силаев Дмитрий (http://orсid.org/0000-0001-6867-953X; ResearcherID: AAQ-8940-2020).

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. V., SotnikovD.V., ZherdevA.V., KhassenovB.B., BaltinK.K., Eskendirova S.Z., MukanovK.K., MukantayevK.K., DzantievB.B. TripleImmuno chromatographic System for SimultaneousSero diagnosisof Bovine Brucellosis, Tuberculosis, andLeukemia // Biosensors (Basel). 2019 Vol.9(4),115. pp. 1-10. doi: 10.3390/bios9040115. (IF-3.24, Q2, Процентиль-84, CS-3.57).
2. Sotnikov D.V., Byzova N.A., Zherdev A.V., Eskendirova S.Z., Baltin K.K.,Mukanov K.K., Ramankulov E.M., Sadykhov E.G., Dzantiev B.B. Express immunochromatographic detection of antibodies against Brucella abortusin cattle sera based on quantitative photometric registration and modulated cut-off level // Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 2015;36(1):80-90. doi: 10.1080/15321819.2014.896266 (Процентиль-33, CS-1.4)
3. Aktayeva, Baltin K., Ramankulov Ye., Khassenov B. Isolation and identification of the keratin degrading bacteria // Journal of Biotechnology. 2019. Vol.305S. P.S30. doi: 10.1016/j.jbiotec.2019.05.112 (Q2, IF-3.503, Процентиль-74, CS-3.09).
4. Nurmagambetova A.B., Akhmetova D.G., KhassenovB., Baltin K.K. Expression and purification of a recombinant Staphylococcal protein a fused to a maltose — binding protein // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. Iss.3. 2017. pp. 56-60.6.doi: 10.11134/btp.3.2017.8 (РИНЦ-0,090).
5. BaltinK., Akishev Zh.D., Abeldenov S.K., Silayev D.V., Khassenov B.B. Biochemical properties of recombinant β-galactosidase from Streptococcus thermophilus // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2017. N.2. P.68-67. doi: 10.11134/btp.2.2017.10 (РИНЦ-0,090).
6. Балтин К.К., Нурмагамбетова А.Б., Хасенов Б.Б., Раманкулов Е.М. Штамм Escherichiacoli BL-21(DE3)/pMBP_His_SPA_5, продуцирующий рекомбинантный белок А из Staphylococcusaureus // Патент Республики Казахстан №33484, 25.02.2019.
7. Sarina N, Abeldenov S, Turgimbayeva A, Zhylkibayev A, Ramankulov Y, Khassenov B,Eskendirova S. Obtaining and characterization of monoclonal antibodies against recombinant extracellular domain of human epidermal growth factor receptor 2 // Human Antibodies. Vol.26. N 2. P.103-111. doi: 10.3233/HAB-170327. (Процентиль-21, CS-1,6).
8. Mussakhmetov A, Shumilin IA, Nugmanova R, Shabalin IG, Baizhumanov T, Toibazar D, Khassenov B, Minor W, Utepbergenov D. A transient post-translational modification of active site cysteine alters binding properties of the parkinsonism protein DJ-1 // Biochemical and Biophysical Research communications. Vol.504(1). P.328-333. doi:10.1016/j.bbrc.2018.08.190 (Q3, IF-2.559, Процентиль-74, CS-2.69)
9. Matta E, Kiribayeva A, Khassenov B, Matkarimov B, Ishchenko A. Insight into DNA substrate specificity of PARP1-catalysed DNA poly(ADP-ribosyl)ation // Scientific Reports. Vol.10(1), P.3699. doi: 10.1038/s41598-020-60631-0. (Q1, IF-3.998, Процентиль-93, CS-4.29).
10. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori // PLoS One. 2018. Vol.13. N 8. e0202232. doi:10.1371/journal.pone.0202232. (Q2, IF-2.74, Процентиль-90, CS-2.97).
11. Kiribayeva A.,Ramanculov E., Khassenov B. Constitutive expression of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris // Journal of Biotechnology. 2017. Vol.256S, P.S64. doi: 10.1016/j.jbiotec.2017.06.1017 (Q2, IF-3.503, Процентиль-74, CS-3.09).
12. Akishev Zh., Taipakova S., Joldybayeva B., Zutterling C., Smekenov I., Ishchenko A.A., Zharkov D.O., Bissenbaev A.K., Saparbaev M. The major Arabidopsis thaliana apurinic/apyrimidinic endonuclease, ARP is involved in the plant nucleotide incision repair pathway // DNA Repair. Vol 48: P.30-42. doi:10.1016/j.dnarep.2019.102698 (Q2, IF-3.388, Процентиль-71, CS-3.36).
13. Akishev Zh., Abeldenov S., Ramanculov E., Khassenov B. Expression of camel (Camelus bactrianus) and bovine (Bos taurus) chymosin in Pichia (Komagataella) pastoris // Journal of Biotechnology. 2017. Vol.256S, P.S73–S74. doi: 10.1016/j.jbiotec.2017.06.1050 (Q2, IF-3.503, Процентиль-74, CS-3.09).
14. Abeldenov, S., Talhaoui, I., Zharkov, D.O., Ishchenko, A.A., Ramanculov, E., Saparbaev, M., Khassenov, B. Characterization of DNA substrate specificities of apurinic/apyrimidinic endonucleases from Mycobacterium tuberculosis // DNA Repair. Vol.33, P.1-16. doi:10.1016/j.dnarep.2015.05.007. (Q2, IF-3.339, Процентиль-71, CS-3.36).
15. Хасенов Б.Б., Раманкулов Е.М. Способ получения рекомбинантного нуклеокапсидного белка p24 вируса лейкоза крупного рогатого скота путем плазмиднойэ кспрессии гена в клетках Escherichiacoli // Патент Республики Казахстан №26721, 11.03.2013.
16. Ескендирова С.З., Сарина Н.И., Хасенов Б.Б., Абельденов С.К., Тургимбаева А.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus L. – Mab/1E7-Her2/ECD – продуцент моноклональных антител к внеклеточному домену (Her2-2/ECD) рецептора эпидермального фактора роста Her-2/neu // Патент Республики Казахстан №33368, 08.01.2019.
17. Kalendar, R., Khassenov, B., Ramankulov, Y., Samuilova, O., Ivanov, K.I. FastPCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis // Genomics. Vol.109, P.312-319.doi: 10.1016/j.ygeno.2017.05.005 (Q2, IF- 2.91, Процентиль-61, CS-2.77).

Достигнутые результаты

2021 г.

Получены штаммы-продуценты рекомбинантных антигенов RBD и S коронавируса SARS-CoV-2. Выделены и очищены рекомбинантные антигены RBD и S коронавируса SARS-CoV-2.

2022 г.

Проведен биоинформатический анализ последовательностей белков SpA и SpG бактерий Staphylococcus aureus и Streptococcus sp. Клонированы фрагменты генов SpA, SpG и гена пероксидазы хрена и создана экспрессионная генно-инженерная конструкция.