Изучение влияния экспрессии гена р19 на эффективность направленного мутагенеза, на основе технологии CRISPR/Сas9, для снижения редуцирующих сахаров в клубнях картофеля при действии низких температур.
Редактирование генома при использовании CRISPR/Cas9стало прорывной технологией в области генетики и селекции растений. Геномное редактирование оказывает точное и целенаправленное действие, что приводит к резкому снижению временных затрат и созданию сортов с заданными свойствами по сравнению с методами классического мутагенеза, которые опираются на случайные события. В настоящее время продемонстрирована универсальность данной технологии и возможность ее успешного применения не только на модельных, но и на культурных растениях при использовании разных методов трансформации.
В данном проекте предлагается изучение влияния экспрессии гена р19 на эффективность направленного мутагенеза, на основе технологии CRISPR/Сas9,для снижения редуцирующих сахаров в клубнях картофеля при действии низких температур.
Проект будет реализовываться командой владеющих методами генетической инженерии растений, в том числе методами геномного редактирования, где работают специалисты области молекулярной биологии и биотехнологии растений. Научная новизна исследований заключается в том, что планируется изучить влияния ко-экспрессии гена р19 на уровень экспрессии Cas9 и sgRNA, следовательно, на эффективность направленного мутагенеза; инактивировать ген, стимулирующий накопление редуцирующих сахаров в клубнях картофеля, при действии низких температур, с помощью CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования и в короткие сроки создать отредактированные растения на основе хорошо адаптированных высокоурожайных отечественных сортов картофеля. Планируемые исследования являются абсолютно новыми, нам не известны опубликованные работы по изучению влияния ко-экспрессии гена р19 на уровень экспрессии Cas9 и sgRNA, также как по разработке технологии CRISPR/Сas9 для снижения редуцирующих сахаров в клубнях картофеля.
Практическая значимость предлагаемого к реализации проекта заключается в том, что будет получена линия перспективных форм картофеля, характеризующихся улучшенным качественным хозяйственно-ценным признакам. Кроме того, результаты данного проекта смогут оказать прямое влияние на программы селекции сортов картофеля с комплексом хозяйственно-ценных признаков, информация, полученная в ходе его выполнения, будет способствовать дальнейшему прогрессу в использовании данной технологии для редактирования генома других сельскохозяйственных культур.
Изучение влияния экспрессии гена р19 на эффективность направленного мутагенеза, на основе технологии CRISPR/Сas9, для снижения редуцирующих сахаров в клубнях картофеля при действии низких температур.
Манабаева Шуга Аскаровна. Индекса Хирша 2. https://publons.com/researcher/2449535/shuga-a-manabayeva/ ; ResearcherID Web of Science: A-2529-2015
2021 г.
Для снижения уровня редуцирующих сахаров картофеля с помощью CRISPR/Сas9 выбран ген Pain-1, кодирующего вакуолярную инвертазу. Участки экзонов 1 и 3 гена Pain-1 определены как потенциальные сайты модификации и направляющие олигонуклеотиды химерной направляющей РНК с помощью биоинформатических программ https://crispr.dbcls.jp/ и http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/. Проанализированы тринуклеотиды NGG в изучаемых экзонах и для каждого тринуклеотида проанализирована нуклеотидная композиция из 20 нуклеотидов, расположенных на 5′ – конце РАМ, выбраны последовательности с наименьшим числом неспецифичных мест связывания в геноме картофеля. В результате клонирования вариабельных частей к константной части, направляющей РНК по сайтам BbsI получены следующие промежуточные векторные конструкции: р203+Т1, р204+Т2, р205+Т3.
Для редактирования гена Pain-1 картофеля с помощью CRISPR/Cas9 выбраны бинарные экспрессионные вектора pMR284 и pMR287, кодирующие Cas9 под промотором PcUbi. В результате клонирования экспрессионной кассеты с химерной направляющей РНК под промотором U6 в бинарные вектора pMR284 и pMR287 с помощью системы Gateway созданы экспрессионные бинарные вектора, содержащие все элементы, необходимые для модифицирования целевых сайтов гена Pain-1 и функционирования системы CRISPR/Cas9 в клетках генома картофеля.
Создан экспрессионный вектор с геном, кодирующий белок р19 для изучения влияния ко-экспрессии гена р19 на эффективность направленного мутагенеза для снижения уровня редуцирующих сахаров картофеля с помощью CRISPR/Сas9.
2022 г.
Для микроклонального размножения пробирочных растений картофеля сортов Аксор, Тохтар и Астаналык используется безгормональная питательная среда с рН 5,7-5,8, содержащей минеральные соли и витамины по Мурасиге и Скуга. Микрочеренкование пробирочных растений проводятся каждые 3-4 недели. Культивирование пробирочных растений картофеля осуществляются в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде — 16 часов, температуре 23-25°С и влажности воздуха 70-75%.
Agrobacterium-опосредованная трансформация эксплантов картофеля проводятся с помощью агробактериального штамма AGLO. Агробактериальные клетки содержат генетическую конструкцию, клонированную в бинарный вектор на основе Ti плазмиды. Генетическая последовательность содержит кассеты с тремя таргетами, комплементарными к последовательности гена кислой вакуолярной инвертазы под промоторами AtU6 и последовательностью белка Cas9. Agrobacterium-опосредованная трансформация проводятся методом ко-культивации эксплантов. С помощью плазмиды pMR284 протрансформировано 720 каллусов. С помощью плазмиды pMR287 протрансформированы стеблевые экспланты картофеля, используя 1115 эксплантов. В результате мониторинга на наличие генов в 163 растениях регенерантах, полученных из трансформированных эксплантов выявлено наличие вставки для 10% растений.
2021 г.
Tussipkan Dilnur and Manabayeva Shuga A. Employing CRISPR/Cas technology for the improvement of potato and other tuber crops // Frontiers in Plant Science. – 2020, V. 12, p.1-16. doi: 10.3389/fpls.2021.747476