В проекте запланировано изучение распределения и роли пост-трансляционных модификации транскрипционных факторов плюрипотентности, выделенных из биотинилированных и небиотинилированных фракции ядер клеток млекопитающих HEK293T и CHO с помощью масс-спектрометрии. Еще одной задачей проекта является идентификация белков-партнеров Sox2, Oct4 и Nanog с применением мутантной биотин-лигазы TurboID.

Актуальность

На сегодняшний момент, детали процессов начала перепрограммирования клетки на молекулярном уровне еще недостаточно изучены. Новизна предлагаемого проекта состоит в том, что для изучения этих механизмов мы будем использовать два новых метода, которые позволят исследовать два основных аспекта этих процессов.

Первый метод — биотинилирование от сближения (PUB), основан на сайт-специфичном мечении биотином мишени BAP при сближении с биотин-лигазой дикого типа BirA. С применением этого метода мы планируем получить сравнительные качественные и количественные данные о пост-трансляционных модификациях (например, гликозилирование и фосфорилирование) транскрипционных факторов плюрипотентности Sox2, Oct4, Nanog, выделенных из биотинилированных и небиотинилированных фракции лизатов ядер. Поскольку наличие биотиновой метки свидетельствует о взаимодействии белков, таким образом, мы получим информацию о роли пост-трансляционных модификации в их регулировании.

Второй метод основан на неспецифическом мечении биотином белков ближайшего окружения мутантной версией биотин-лигазы TurboID. Использование этого метода, позволит выделить и идентифицировать ближайшие белки-партнеры Sox2, Oct4 и Nanog.

Оба метода основаны на схожих принципах, это создание постоянной ковалентной метки in vivo на одном из интересующих нас белков или взаимодействующих с ними партнеров, что позволяет обойти ограничения, накладываемые этапами экстракции и очистки. В конечном итоге, получаются результаты с гораздо меньшим количеством ложно-положительных и ложно-отрицательных идентификации белков в сравнении с традиционным методами, такими как IP-MS/MS или TAP.

Цель

Разработка способа мониторинга и количественного анализа пост-трансляционных модификаций рекомбинантных белков на основе транскрипционных факторов плюрипотентности Sox2, Oct4, Nanog, а также идентификация их белков-партнеров в ядрах эукариотических клеток с использованием сайт-специфичного и неспецифичного биотинилирования in vivo.

Ожидаемые результаты

1. Будут получены данные по роли и распределению пост-трансляционных модификации рекомбинантных белков, экспрессируемых в клетках HЕК293T и CHO.
2. Будет оптимизирован протокол выделения биотинилированных и небиотинилированных фракции рекомбинантных белков BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog из лизатов ядер клеток HEK293T и CHO.
3. Будут получены результаты по идентификации и количественному анализу модифицированных форм BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog из клеток HEK293T и CHO.
4. Будут идентифицированы белки-партнеры Sox2, Oct4 и Nanog с использованием мутантной биотин лигазы TurboID.
5. Будут получены генно-инженерных конструкции TurboID-Sox2, TurboID-Oct4 и TurboID-Nanog и оптимизирован протокол выделения биотинилированных белков из лизатов ядер клеток HEK293T и CHO.
6. Будут получены результаты по идентификации и количественному анализу белков-партнеров Sox2, Oct4 и Nanog с помощью метода жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии.
7. Будут применены методы протеомики с использованием стабильных изотопов и биоинформатического анализа результатов с помощью программ MaxQuant и Skyline
8. Будет проведена экспрессия рекомбинантных белков транскрипционных факторов плюрипотентности в средах SILAC
9. Будет проведена идентификация и количественный анализ модифицированных форм и белков-партнеров с помощью MaxQuant и Skyline

Руководитель проекта

Кулыясов Арман Табылович, руководитель проекта – кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории протеомики и масс-спектрометрии НЦБ РК. Индекс Хирша (h-index) – 8.

Author ID в Scopus 7004152301; Researcher ID Web of Science K-9148-2017

ORCID ID 0000-0002-7932-5689; Researcher ID in Publons K-9148-2017

 Члены исследовательской группы

Ахметоллаев Ильяс Амирханович, кандидат биологических наук ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией органического синтеза РГП «Национальный центр биотехнологии», специалист в области молекулярной биологии и химического синтеза олигонуклеотидов и их модификации. Роль в проекте — химический синтез олигонуклеотидов и их модификаций.

Кулмамбетова Гульмира Нигметжановна, PhD, старший научный сотрудник. Индекс Хирша (h-index) – 2.  Author ID в Scopus 56387533800; Researcher ID Web of Science N-5975-2017; ORCID ID0000-0001-8723-3752; Researcher ID in Publons N-5975-2017.

Кожахметова Сания Саттыбаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП «Национальный центр биотехнологии». ORCID ID 0000-0002-8772-0507

Мухтарова Кымбат Ерланкызы, магистр в области общественного здравоохранения, школа медицины Назарбаев университета, младший научный сотрудник Национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП «Национальный центр биотехнологии». Роль в проекте: получение плазмидных конструкции, содержащих последовательность TurboID, работа с культурами эукариотических клеток.

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. Shoaib M., Kulyyassov A., Robin C., Winczura K., Tarlykov P., Despas E., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-NChIP – “in vivo biotinylation” approach to study chromatin in proximity to a protein of interest // Genome Research.-2013.-Vol.23, №2.-P.331-340. doi:10.1101/gr.134874.111 (Q1)
2. Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K., Kulyyassov, A.T. and Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma GPR161 receptor.//Asia Pac. J. Mol. Biotechnol.- 2019.-Vol. 27 (4) .-P. 85-95. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10 (Q4)
3. Kulyyassov A., Ogryzko V. In Vivo Quantitative Estimation of DNA-Dependent Interaction of Sox2 and Oct4 Using BirA-Catalyzed Site-Specific Biotinylation // Biomolecules. ‒ 2020. ‒ Vol. 10, № 1. DOI: 10.3390/biom10010142 (Q1)
4. Adish Zh., Mukantayev K., Tursunov K., Ingirbay B., Kanayev D., Kulyyassov A., Tarlykov P., Mukanov K., Ramankulov Y. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor // Reports of Biochemistry and Molecular Biology. ‒ 2020. ‒ Vol.8, №4. ‒ P.347-357. http://rbmb.net/article-1-391-en.html (Q3)
5. Кулыясов А.Т., Раманкулов Е.М., Огрызько В.В. Евразийский патент. Номер 034880. Номер заявки №201500724. Дата подачи 28.05.2015. Дата публикации и выдачи 01.04.2020. Применение биотин-лигазы BirA и пептидов-акцепторов биотина BAP1070 и BAP1108 для детектирования белок-белковых взаимодействий in vivo с использованием пар Bira/BAP1070 и Bira/BAP https://www.eapo.org/ru/patents/reestr/patent.php?id=34880
6. Кулыясов А.Т., Огрызько В.В. Рекомбинантная плазмида pcDNA1(+)-BAP-HP1a, кодирующая гетерохроматиновый белок человека HP1a и обеспечивающая его экспрессию в клетках НЕК293Т. Патент Республики Казахстан на изобретение, регистрационный номер 2013/1352.1. Номер 30034, бюллетень №6, http://kazpatent.kz/images/bulleten/2015/gazette/pdf/2-201506.pdf
7. Кулыясов А.Т., Огрызько В.В. Рекомбинантная плазмида pcDNA1(+)-BAP-KAP1, кодирующая белок транскрипционного кофактора человека KAP1 и обеспечивающая его экспрессию в клетках НЕК293Т. Патент Республики Казахстан на изобретение, регистрационный номер 2013/1377.1. Номер 30035, бюллетень №6, http://kazpatent.kz/images/bulleten/2015/gazette/pdf/2-201506.pdf
8. Kulyyassov A., Shoaib M., Pichugin A., Kannouche P., Ramanculov E., Lipinski M., Ogryzko V. PUB-MS: A Mass Spectrometry-based Method to Monitor Protein-Protein Proximity in vivo //J. Proteome Res.-2011 .-Vol.10, No.10.-P.4416-4427. doi: 10.1021/pr200189p.
9. Kulyyassov A., Shoaib M., Ogryzko V. Use of in vivo biotinylation for chromatin immunoprecipitation // Curr. Protoc. Cell Biol.-2011.- Chapter 17, Unit17.12. doi: 10.1002/0471143030.cb1712s51.
10. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M., Ogryzko V.V. In vivo Biotinylation Based Method for the Study of Protein-Protein Proximity in Eukaryotic Cells// Cent Asian J Glob Health. — 2014 Cent Asian J Glob Health. — 2014 Jan 24;2(Suppl):96. doi: 10.5195/cajgh.2013.96. eCollection 2013.
11. Kulyyassov A., Zhubanova G, Ramanculov E, Ogryzko V. Proximity Utilizing Biotinylation of Nuclear Proteins in vivo. // Cent Asian J Glob Health. — 2015 Jun 15;3(Suppl):165. doi: 10.5195/cajgh.2014.165. eCollection 2014.
12. Issabekova A.S., Zhunusova M.S., Ramanculov E.M., Kulyyassov A.T. Comparison and optimization of transient transfection methods at HEK293T cell line. // Eurasian journal of applied biotechnology.-2017.- No.1.-P.38-43. DOI: 10.11134/btp.1.2017.5
13. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M., Ogryzko V.V. Cloning and expression of recombinant protein of SUMO, fused with biotin acceptor peptide // Eurasian journal of applied biotechnology. — -№1. — P.37-41. DOI: 10.11134/btp.1.2018.6
14. Kulyyassov A.T., Ramanculov E.M. Applications of the Impact II high resolution quadrupole time-of-flight (QTOF) instrument for shotgun proteomics // Eurasian journal of applied biotechnology. — -№3. — P.3-18. DOI: 10.11134/btp.3.2018.1
15. Kozhakhmetova S., Aitkulova A., Zholdybayeva E., , Atavliyeva S., Tarlykov P., Kassymbek K., Nugmanova R., Cyzdykov A., Ramankulov Y. Study of antibiotic sensitivity of Bacteroides fragilis isolated from patients with intraabdominal infections // Journal of Biotechnology. – 2019. — Vol. 305. — P. 87. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2019.05.301
16. Kozhakhmetova S.S., Zholdybayeva E.V., Mukhtarova K.E., Ramankulov Ye.M. Pathogenicity factors and antibiotic resistance of the Bacteroides fragilis // Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2020, №1, pp. 3-13. DOI: 10.11134/btp.1.2020.1
17. Yessimseitova A.K., Shustov A.V., Ahmetollaev I.A., Krassavin V.F., Kakimzhanova A.A. Molecular-genetic certification of potato varieties and forms using SSR-markers // Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2015, №2, pp. 4-16. DOI: 10.11134/btp.2.2015.6.
18. Kulmambetova G.N., Imanbekova MK, Logvinenko AA, Sukashev AT, Filipenko ML, Ramanculov EM. Association of cytokine gene polymorphisms with gastritis in a Kazakh population..// Asian Pac J Cancer Prev. 2014;15(18): 7763-8. DOI: 10.7314/APJCP.2014.15.18.7763. (процентиль -57).
19. Shtefanov, I.I., Kulmambetova, G.N., Zhakipova, A.A., Popova, М.R., Makishev, A.K. Clinical cases of inguinal lymph node and right testicular metastases in gastric cancer // Asia Life Sciences Volume 28, Issue 2, 2019, P. 399-419

Достигнутые результаты

2021 г.

Проведена оптимизация протокола выделения биотинилированных и небиотинилированных фракций рекомбинантных белков BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog из лизатов ядер клеток HEK293T и CHO с использованием различных методов и коммерческих наборов. Фракций, содержащие биотинилированные белки выделяли с использованием магнитных частиц покрытых стрепативидином. В экспериментах применяли два типа частиц из коммерческих наборов следующих компаний:

1. Dynabeads MyOne Streptavidin, ThermoFisher Scientific, Catalog number: 650.01
2. BD IMag Streptavidin particles Plus, BD Bioscience, Catalog number: 557812

Методика с использованием магнитных частиц со стрептавидином Streptavidin MyOne Dynabeads оказалась более эффективной для селективного выделения биотинилированных белков. Например, белки, BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog из лизатов ядер клеток HEK293T и CHO и содержащие биотиновую метку практически полностью и количественно были извлечены из смеси белков. Использование буферных растворов, содержащих 3М гуанидина гидрохлорида, улучшало специфичность связывания целевых биотинилированных белков с частицами и позволяло получать более чистые элюаты.

Методика с использованием никель агарозных частиц, в отличие от предыдущего метода позволяет выделить все рекомбинантные белки BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog, вне зависимости имеют ли они биотиновую метку или нет, поскольку они все содержат His-tag маркерный пептид. Определив соотношение биотинилированных и небиотинилированных гибридных белков с помощью тандемной хромато-масс спектрометрии LC-MS/MS в таргетном режиме MRM можно количественно оценить степень взаимодействия белков в парах BAP-Sox2+BirA-Oct4, BAP-Sox2+BirA-Nanog, BAP-Nanog+BirA-Sox2 или BAP-Oct4+BirA-Nanog. В экспериментах были использованы смеси после экспрессии белков BAP-Sox2+BirA-Oct4, из-за высокого выхода биотинилированного продукта, по сравнению с другими комбинациями. Для увеличения специфичности связывания целевых белков с никелем, все этапы опытов проводили в буферном растворе содержащем 6М гуанидин.

Таким образом, по результатам выполнения данного этапа установлено, что наиболее подходящим набором для выделения биотинилированных фракций рекомбинантных белков BAP-Sox2, BAP-Oct4 и BAP-Nanog из лизатов ядер клеток HEK293T и CHO является набор Dynabeads MyOne Streptavidin (ThermoFisher Scientific), который в два раза эффективнее другого набора BD IMag. Наиболее оптимальным буферным раствором для выделения всех биотинилированных и небиотинилированных фракций рекомбинантных белков является 6М раствор гуанидина гидрохлорида в PAT буферном растворе.

2022 г.

Для получения получения генно-инженерных конструкций содержащих мутированную версию биотин-лигазы TurboID проведен дизайн олигонуклетидов-праймеров, содержащих сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции BglII и XhoI, что позволило провести клонирование по этим сайтам в векторные плазмиды pOzFHHN.BirA.X (где X-GFP, Sox2, Oct4, Nanog) с заменой BirA на TurboID.

Праймеры (сайты рестрикции BglII и XhoI выделены, синим цветом), His-tag зеленым, а N-концы и C-концы TurboID красным цветом:

Primer TurboID_BirA_1_FD (50-mer):

CACACACAAGATCTGCCACCATGGGCAAAGACAATACTGTGCCTCTGAAG

      BglII

Primer TurboID_BirA_2_RS (56-mer):

TGTGTGTGCTCGAGGTGGTGATGGTGATGATGCTTTTCGGCAGACCGCAGACTGAT

      XhoI           His tag                            

В качестве ДНК матрицы для ПЦР использовали плазмиду V5-TurboID-NES_pCDNA3 (Plasmid #107169 in Addgene depository), любезно предоставленную авторами статьи PubMed 30125270.

Полученный ампликон TurboID клонировали в вектора pOz.BirA.X. Условия ПЦР: денатурация 94 °С — 15 сек, отжиг 54 °С — 30 сек, элонгация 72 °С — 1 мин, количество циклов – 20.

Микс 1. Праймеры (Primer 1, Primer 2) — 0.5 мкл, матрица ДНК (100 мкг) — 0.5 мкл, Н₂О — 18.5 мкл, dNTP (2,5 мМ) — 5.0 мкл. Общий объем – 25.0 мкл.

Микс 2. Буфер ПЦР с KCl (5х) — 10.0 мкл, MgSO₄ — 10.0 мкл, ДНК-полимераза Pwo (Roche, 11 644 947 001) – 1.0 мкл, Н₂О — 4.0 мкл. Общий объем – 25.0 мкл.

Пробирку после смешивания миксов 1 и 2 на вортексе и откручивания загрузили в ПЦР амплификатор. Часть продуктов ПЦР-реакции (10 мкл или 1/5 часть от объема) для визуализации подвергали электрофорезу в 0.8% агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. В случае обнаружения на геле продуктов амплификации, оставшуюся часть ПЦР-продуктов (40 мкл) помещали в пробирки с фильтрующими элементами из набора для очистки продуктов ПЦР фирмы  Millipore (номер по каталогу P36461, Rev. A, 03/05) и добавили 300 мкл воды. Для удаления солей и праймеров откручивали в центрифуге при 1000 g, в течение 15 мин. Далее в фильтрующий элемент, содержащий амплифицированную ДНК, добавляли 20 мкл воды, переворачивали, вставляли  в новую пробирку из набора и центрифугировали 2 мин при 1000 g.

Векторную ДНК pOz.BirA.X (1 мкг), а также продукт ПЦР-амплификации TurboID подвергали гидролизу рестриктазами BglII и XhoI (20 е.а. в 20 мкл реакционной смеси) в соответствующих буферных растворах при 37 °С в течение 2 часов. Гидролизат разделяли с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле, затем окрашивали с помощью бромистого этидия. Визуализированные в УФ-свете фрагменты вырезали, помещали кусочки геля в пробирки, из набора для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Millipore (номер по каталогу LSKGEL050) и центрифугировали при 5000 g, 10 мин. Лигирование полученных на предыдущей стадии вектора и фрагмента ДНК осуществляли с помощью лигазы фага Т4 в течение ночи при 4 °С.

После трансформации компетентных клеток E. coli штамма DH5a, и отбора клонов, несущих рекомбинантные плазмиды со встроенным геном, получены плазмиды pOz.TurboID.GFP, pOz.TurboID.Sox2, pOz.TurboID.Oct4 и pOz.TurboID.Nanog. Правильность сборки плазмид, и отсутствие ошибок в нуклеотидной последовательности проверяли с помощью метода секвенирования по Сэнгеру.  Вектора, не содержащие эндотоксины, нарабатывали с помощью наборов для выделения плазмидной ДНК (Sigma, PLED35-1KT или Qiagen, 12362), согласно протоколам приведенных в инструкциях или на сайтах компаний-производителей. 

Полученные плазмиды использовали для трансфекции клеток HEK2923T. Лизаты клеток, содержащие биотилированные белки анализировали с использованием метода Вестерн-блоттинга.  В настоящее время проводиться оптимизация условий выделения биотинилированных белков из различных фракций клеток HEK2923T и CHO.

Публикации и охранные документы

2021 г.

1. Kulyyassov A., Fresnais M., Longuespee R. Targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of proteins: Basic principles, applications, and perspectives // Proteomics. ‒ 2021. ‒ 21, № 23-24, e2100153. – P.1-20. – doi: 10.1002/pmic.202100153, PMID: 34591362, IF3.984, Q2 (2020, WoS), percentile 73 on Biochemistry, CiteScore 6.3 (2020, Scopus);
2. Kulyyassov A. Application of Skyline for Analysis of Protein–Protein Interactions In Vivo // Molecules. ‒ 2021. ‒ Vol. 26, № 23, 7170, –1-11. – doi: 10.3390/molecules26237170, PMID: 34885753, IF4.412, Q2 (2020, WoS), percentile 74 on Chemistry, CiteScore 4.7 (2020, Scopus);

2022 г.

1. Kulyyassov A., Ramankulov Y., Ogryzko V. Generation of Peptides for Highly Efficient Proximity Utilizing Site-Specific Biotinylation in Cells // Life (Basel). ‒ 2022. ‒ Vol. 12, № 2, 300. ‒ P.1-14. – doi: 10.3390/life12020300, PMID: 35207587,817, Q2 (2020, WoS), percentile 50 on General Biochemistry, Genetics and Molecular Biology, CiteScore 2.6 (2020, Scopus);
2. Application of BirA biotin ligase and BAP1070 and BAP1108 biotin acceptor peptides for detecting protein-protein interactions in vivo using BirA/BAP1070 and BirA/BAP1108 pairs. Application EA-034880-B1. European Patent register: https://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/biblio?CC=EA&NR=201500724&KC=&FT=E&locale=en_EP