AP09259771 Характеристика новых программируемых РНК-направляемых эндонуклеаз CRISPR/Cas систем для применения в диагностике

Доступ к быстрым и надежным методам обнаружения нуклеиновых кислот имеет решающее значение во многих различных областях. Своевременное выявление патогенов на основе их генетической информации, связанных с различными заболеваниями, делает возможными раннюю диагностику и лечение.

Ситуация с пандемией COVID-19 показала, что именно сейчас существует острая необходимость в поиске ферментов для новых методов диагностики, основанных на современных фундаментальных знаниях. Методы, которые позволят охватить больший спектр применения, будут дешевле и не требовать специализированных помещений, квалифицированных сотрудников и будут просты в исполнении.

Один из таких методов основывается на недавно обнаруженной эндонуклеазе CRISPR/Cas систем – Cas12a. В данном проекте планируется провести структурно-функциональную характеристику Cas12a.

Актуальность

Быстрое появление технологии CRISPR/Cas для манипулирования геномом произвело революцию в области наук о жизни. Многие бактерии обладают адаптивным иммунитетом с помощью разнообразного набора CRISPR/Cas систем. Помимо терапевтического потенциала, недавно было обнаружено, что технологию CRISPR можно использовать и в диагностике. Помимо высокоспецифичного расщепления дцДНК, Cas12a также проявляет неизбирательную активность деградации оцДНК. Эта активность проявляется практически всеми ортологами Cas12a и расщепляет любую доступную молекулу оцДНК. Такие эндонуклеазы как Cas12a, Cas13a, и Cas14 обладают коллатеральной активностью, что было использовано в детекции нуклеиновых кислот. Данные платформы обеспечивают аттомолярную чувствительность и специфичность для обнаружения различных мишеней нуклеиновых кислот. Научная новизна проекта состоит в том, что впервые будут биохимически охарактеризованы ферменты геномного редактирования Cas12a (Moraxella bovis) и Cas12a (Moraxella equi). Предполагается, что активность в неспецифическом расщеплении одноцепочечной ДНК будет сравнима по сравнению с известными и охарактеризованными на сегодняшний день гомологами. Фундаментальная новизна этой работы заключается в расширении инструментов геномного редактирования для конкретных практических целей, особенно в области диагностики.

Значимость и применимость ожидаемых результатов данного проекта очень высокая. В связи с вышеупомянутым, поиск и обнаружение новых не изученных гомологов Cas12a расширит функциональную характеристику ферментов семейства и описание их кинетики взаимодействия с гидовой РНК и целевыми последовательностями ДНК, создаст альтернативы для использования в определенных практических приложениях. Описание функциональных особенностей новых изучаемых эндонуклеаз откроет возможности для поиска ферментов с более высокими кинетическими параметрами, необходимыми для быстрого процессинга нуклеиновых кислот, что позволит сократить время реакции.

Цель

Структурно-функциональное изучение ранее не изученных эндонуклеаз CRISPR/Cas систем.

Ожидаемые результаты

Будут созданы генетические конструкции способные к репликации в клетках Escherichia coli и несущие гены эндонуклеаз Cas12a.
Будут получены высокоочищенные рекомбинантные аналоги эндонуклеаз Cas12a.
Будет проведен дизайн и синтезированы гидовые РНК. Будет проведена сборка рибонуклеопротеинового комплекса Cas12a-гидовая РНК и определена его специфичная активность расщепления молекулы ДНК в условиях in vitro. Будет определена активность эндонуклеазы Cas12a относительно различных субстратов.
Будет проведен подбор оптимальных условий биохимической реакции (температура и время реакции, концентрация компонентов реакции, состав реакционного буфера).
Будет проведен скрининг условий кристаллизации изучемых ферментов. Результаты будут использованы для изучения структурно-функциональных отношений.
Будет проведена оценка ферментативной активности расщепления ДНК в сравнении с известными гомологами. Будут подготовлены публикации и итоговый отчет по проекту.

Руководитель проекта

Абельденов Сайлау Касенович, PhD, Web of Science ResearcherID F-5139-2015

Члены исследовательской группы

Тургимбаева Айгерим Макашкызы, Web of Science ResearcherID N-6857-2017

Кириллов Савелий Олегович, Web of Science ResearcherID N-6322-2017

Публикации и охранные документы по теме проекта

Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. PLoS One. 2018 Aug 15;13(8):e0202232. doi: 10.1371/journal.pone.0202232. eCollection 2018.
Obtaining and characterization of monoclonal antibodies against recombinant extracellular domain of human epidermal growth factor receptor 2. Sarina N, Abeldenov S, Turgimbayeva A, Zhylkibayev A, Ramankulov Y, Khassenov B, Eskendirova S. Hum Antibodies. 2018 Feb 5;26(2):103-111. doi: 10.3233/HAB-170327.
Characterization of DNA substrate specificities of apurinic/apyrimidinic endonucleases from Mycobacterium tuberculosis. Abeldenov S, Talhaoui I, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramanculov E, Saparbaev M, Khassenov B. DNA Repair (Amst). 2015 Sep;33:1-16. doi: 10.1016/j.dnarep.2015.05.007. Epub 2015 May 22.
Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov DO, Ishchenko AA, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. PLoS One. 2018 Aug 15;13(8):e0202232. doi: 10.1371/journal.pone.0202232. eCollection 2018.
Heterologous extracellular expression of bacterial phytase (AppA) in Pichia pastoris and it biochemical characterization. Eurasian_journal_of applied biotechnology, 2016
Expression, purification and biochemical characterization of recombinant phosphohydrolase AppA in Escherichia coli. Биотехнология. Теория и практика, Астана, 2014
Extracellular expression of acid phytase AppA in Pichia pastoris. Conference for Young Scientists, 2015, Kyiv, Ukraine
Cloning and purification of large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus stearothermophilus and it’s application in isothermal DNA amplification. Eurasian journal of applied biotechnology 2017
Expression and purification of DNA polymerase from Thermus thermophilus in E.coli expression system. Eurasian journal of applied biotechnology 2017
Абельденов С.К., Раманкулов Е.М., Сапарбаев М.К., Хасенов Б.Б. Получение мутантных форм микобактериальной АП эндонуклеазы MtbXthA. Вестник Казахского Национального Университета имени аль-Фараби. 2015.
Абельденов С.К., Раманкулов Е.М., Сапарбаев М.К., Хасенов Б.Б. Репарационная активность микобактериального белка MtbNfo. Научный журнал «Вестник» Евразийского Национального Университета имени Л.Н. Гумилева, 2015.
Рекомбинантный штамм Esсherichia coli ArcticExpress(DE3)RP/pAppA, продуцирующий фосфогидролазу AppA, №
Способ получения термостабильной ДНК полимеразы бактерии Thermus aquaticus Taq-pol с помощью рекомбинантного штамма Esсherichia coli BL21/pTPh, №
Способ получения термостабильной ДНК полимеразы бактерии Thermus aquaticus Taq-pol с помощью рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3) /pTPM, № 29152
Штамм Esсherichia coli BL21(DE3)/pTth, продуцирующий термостабильную рекомбинантную ДНК полимеразу бактерии Thermus thermophilus, № 33100
Рекомбинантный штамм Pichia pastoris X-33/AppA, продуцирующий бактериальную фитазу AppA, № 32368.

Достигнутые результаты

2021 г.

Получены гены ферментов Cas12a (Moraxella bovis) и Cas12a (Moraxella equi). Получены генетические конструкции на основе различных экспрессионных векторов. Подтверждено отсутствие делеций, вставок и мутаций в генах эндонуклеаз. Проведена трансформация клеток E. coli, подобраны условия экспрессии и очистки и наработаны различные формы рекомбинантных белков Cas12a. Проведен дизайн и синтез гидовых РНК. Проведена сборка рибонуклеопротеинового комплекса Cas12a-гидовая РНК и проверка его специфичной активности расщепления молекулы ДНК в условиях in vitro.

2022 г.

Определена последовательность PAM-участка. Определена активность эндонуклеазы Cas12a относительно различных субстратов. Проведен подбор оптимальных условий биохимической реакции (температура и время реакции, концентрация компонентов реакции, состав реакционного буфера). Проведен скрининг условий кристаллизации белков.

Публикации и охранные документы