АР09259225 Изучение видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с инфекциями крупного рогатого скота различной этиологии

Различные виды микоплазм широко распространены в мире, вызывая серьезные заболевания крупного рогатого скота, такие как маститы, артриты, пневмонии, поражения репродуктивной системы. Микоплазмы отличаются высокой контагиозностью, способны вызывать тяжелые заболевания и трудно поддаются лечению. В этой связи, для успешной борьбы и предотвращения вспышек заболеваний, требуется точная информация о видовой принадлежности вовлеченных в патологический процесс видов микоплазм. Идея проекта заключается в изучении видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с болезнями КРС на основании анализа нуклеотидной последовательности рибосомального оперона и генов, кодирующих белки микоплазм. Полученные данные будут использованы для разработки протоколов ПЦР идентификации патогенных микоплазм в биологическом и патологическом материале.

Актуальность

Традиционно, для обнаружения Mycoplasma, поражающих крупный рогатый скот, используют получение и идентификацию микоплазменных культур. Этот метод довольно широко применяется специалистами диагностических лабораторий. К недостаткам следует отнести длительность культивирования, частая контаминация другими микрорганизмами, сложность дифференциации, необходимость наличия в пробе живых микоплазм. Использование ПЦР для обнаружения видов Mycoplasma в различных типах образцов продемонстрировало более высокую эффективность, специфичность и чувствительность и показало высокий потенциал и практичность.

Лабораторная диагностика микоплазмозов животных в Казахстане не развита из-за сложности культивирования патогенов, не изученности вопроса превалирования микоплазмозов и отсутствия диагностических ПЦР тест-систем в Казахстане. Другим важным аспектом является то, что многочисленные виды микоплазм отличаются разной степенью чувствительности к антимикробным препаратам, применяемым для терапии. Широких полноценных исследований по изучению видового разнообразия микоплазм, вовлеченных в патологический процесс при различных инфекциях КРС, ранее в Казахстане не проводилось.

Новизна проекта заключается в получении актуальных данных о видовом разнообразии штаммов Mycoplasma spp вовлеченных в патологический процесс при наиболее распространенных инфекциях КРС. Дополнительно будут получены данные по микробиоценозу – количественный, качественный состав с соотношением микроорганизмов в инфицированном очаге. Будут разработаны протоколы ПЦР для выявления определенных видов микоплазм ассоциированных с инфекциями КРС. Протоколы ПЦР лягут в основу методических рекомендаций по выявлению патогенных микоплазм при различных инфекциях КРС.

Цель

Изучение видового разнообразия штаммов Mycoplasma spp ассоциированных с инфекциями крупного рогатого скота различной этиологии.

Ожидаемые результаты

Будут получены данные по видовому разнообразию Mycoplasma spp ассоциированных с кератоконьюнктивитами, маститами, эндометритами и респираторными инфекциями КРС;

Буду получены актуальные данные по микробиоценозам при кератоконьюнктивитах, маститах, эндометритах и респираторных инфекциях КРС;

Будут разработаны протоколы ПЦР для выявления определенных видов микоплазм ассоциированных с инфекциями КРС;

Будут разработаны методические рекомендации по выявлению патогенных микоплазм при различных инфекциях КРС.

Главная целевая группа потребителей полученных результатов – научные организации и исследователи, занимающиеся проблемами микоплазменных инфекций КРС. Будут расширены знания по видовому разнообразию штаммов Mycoplasma spp ассоциированных с наиболее распространенными патологиями КРС. Будут получены актуальные данные по микробиоценозу – количественному, качественному составу и соотношению микроорганизмов при различных патологиях. Применение полученных данных, позволит ветеринарным специалистам с большей эффективностью проводить терапевтические и профилактические мероприятия.

Руководитель проекта

Куйбагаров Марат Амангельдыевич, кандидат ветеринарных наук, h-индекс-1.

https://orcid.org/0000-0001-7428-7620

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=55933883700

https://publons.com/researcher/3801534/marat-kuibagarov/

Члены исследовательской группы

Шевцова Елена Сергеевна, h-индекс-3. Владеет молекулярно-генетическими методами: выделение ДНК, ПЦР, секвенирование по Сенгеру и с использованием секвенаторов нового поколения (NGS) Ion Torrent, MiSeq, MLVA типирование, клонирование, дизайн праймеров, разработка ПЦР тест-систем.

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56736321900

Бердимуратова Калыш Тлеухановна, магистр, h-индекс-2. Владеет молекулярно-генетическими методами: секвенирование по Сенгеру и с использованием секвенаторов нового поколения (NGS) Ion Torrent, MiSeq, MLVA типирование.

https://orcid.org/0000-0002-3063-8203

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56046816700

Шведюк (Луцай) Виктория Борисовна, магистр. Владеет молекулярно-генетическими методами: секвенирование по Сенгеру, MLVA типирование, ПЦР, ПЦР в реальном времени.

https://orcid.org/0000-0002-2787-8767

Махамед Риза, магистр, имеет практический опыт в области молекулярной биологии, владеет методами секвенирования по Сенгеру, ПЦР, ПЦР в реальном времени

https://orcid.org/0000-0001-8353-6676

Рыскельдина Анара Жанкожаевна, магистр, имеет практический опыт в области молекулярной биологии, владеет методами секвенирования по Сенгеру, ПЦР, ПЦР в реальном времени.

https://orcid.org/0000-0002-7100-2711

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218871763

Публикации и охранные документы по теме проекта

Kuibagarov M, Amirgazin A, Vergnaud G, Shustov A, Ryskeldina A, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequence of Moraxella bovoculistrain KZ-1, isolated from cattle in North Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00670-20. https://doi.org/1128/MRA.00670-20
Kuibagarov M, Kairzhanova A, Vergnaud G, Amirgazin A, Lukhnova L, Izbanova U, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequence of the strain Francisella tularensismediasiatica 240, isolated in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00766-20. https://doi.org/10.1128/MRA.00766-20
Amirgazin A, Vergnaud G, Mukanov K, Kuibagarov M, Karibaev T, Ramankulov Y, Shevtsov A. 2020. Draft genome sequences of three Pasteurella multocidastrains isolated from domestic animals in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc 9:e00487-20. https://doi.org/1128/MRA.00487-20.
Kuibagarov M.A., Kamalova D.K., Shustov A.V., Suminov A.A., Karibaev T.B., Ryskeldina A.Zh., Shevtsov A.B. Moraxella species diversity in infectious bovine keratoconjunctivitis in Northern Kazakhstan //Eurasian Journal of Applied Biotechnology.–2018.–Vol.3.–P.42-47. DOI:10.11134/btp.3.2018.5
Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A., Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan // PLoS One. 2016 Dec 1;11(12):e0167496. eCollection 2016; https://doi.org/1371/journal.pone.0167496
Shevtsov A., Syzdykov M., Kuznetsov A., Shustov A., Shevtsova E., Berdimuratova K., Mukanov K., Ramankulov Y. Antimicrobial susceptibility of Brucella melitensis in Kazakhstan. Antimicrob Resist Infect Control. 2017 6(130). https://doi.org/10.1186/s13756-017-0293-x
Shevtsova, G.Vergnaud, A.B. Shevtsov, A. Shustov, K. Berdimuratova, K.Mukanov, M.Syzdykov, A.Kuznetsov, L.Lukhnova, U.Izbanova, M. L.Filipenko, E.Ramanculov. Genetic diversity of Brucella melitensis in Kazakhstan in relation to world-wide diversity//Frontiers in Microbiology, print 2019. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01897
Izbanova U.A., Lukhnova L.Yu., Meka-Mechenko T.V., Sansyzbaev E.B., Kairzhanova A.D., Shvedyuk V.B., Begimbayeva E.Z., Sushchykh V.Yu., Shevtsov A.B. Biological Properties and Molecular Genetic Characteristics of Bacillus Anthracis Strains Isolated During Anthrax Outbreaks in Kazakhstan in 2016 Acta Biomedica Scientifica. 2019;4(5):43-49. (In Russ.) https://doi.org/29413/ABS.2019-4.5.7
Shevtsov A.B., Lutsay V.B., Kairzhanova A.D., Lukhnova L.Yu., Kulatay T. Zh., Izbanova U.A., Karibaev T.B., Shustov A.V.Optimization of multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis for Bacillus antracis genotyping /Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2/2019, p. 103-113. DOI: 10.11134/btp.2.2019.10
Kairzhanova A.D., Karibaev T.B., Shvedyuk V.B., Tyulegenov S.B., Zharova M.K., Shevtsova E.S., Kuibagarov M.A., Shevtsov А.B. Analysis of genetic homogeneity of Bacillus anthracis vaccine strains STI-1 and B. anthracis 55-VNIIVVIM by MLVA-25/ Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 3/2017, p. 25-32. DOI: 10.11134/btp.3.2017.4
Amirgazin A.O., Shvedyuk V.B., Kuibagarov M.A., Karibaev T.B., Shevtsov A.B. PCR optimization protocol algorithm for identification of microorganisms using Pasteurella multocida /Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 3/2017, p. 33-43. (In Russ.) DOI: 10.11134/btp.3.2017.5
Shevtsov A., Ramanculov E., Shevtsova E., Kairzhanova A., Tarlykov P., Filipenko M., Dymova M., Abisheva G., Jailbekova A., Kamalova D., Chsherbakov A., Tulegenov S., Akhmetova A., Sytnik I., Karibaev T., Mukanov K. Genetic diversity of Brucella abortusand Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16// Infect Genet Evol. – 2015. – Vol.34. – P.173-180. https://doi.org/1016/j.meegid.2015.07.008
Shevtsov, P.Tarlykov, E. Zholdybayeva, Shevtsova, D.Momynkulov, I.Sytnik, T.Karibaev, A.Chsherbakov, K.Momynaliev. Draft Genome Sequence of the Live Vaccine Strain Brucella abortus 82. Genome Announc. 2013 Dec 26;1(6). pii: e01101-13. https://doi.org/10.1128/genomeA.01101-13.
Berdimuratova K.T., Amirgazin A.O. Kuibagarov М.А., Lutsay V.B., Mukanov K.K., Shevtsov A.B. Optimization of pcr purification using silica-coated magnetic beads // Eurasian Journal of Applied Biotechnology.-2020.- P.81-89. DOI: 10.11134/btp.1.2020.8
Kairzhanova A.D., Temirbayeva M.A.,b Atygayeva S.K., Abdrakhmanova, Shveduyk V.B., Zh.U., Shustov A.V., Stoyanova L.G., Kuibagarov M.A., Shevtsov A.B. SPA-typing of Staphylococcus aureus isolated in Astana. ISSN 2617-1139/Eurasian journal of applied biotechnology. No. 3, Astana, September 2018, 48-54. DOI: 10.11134/btp.3.2018.6

Достигнутые результаты

2021 г.

Для дизайна праймеров специфичных к Mycoplasmac spp., были использованы последовательности rpoB гена и 16S rRNA. Всего было подобрано 8 праймеров, близких по температуре отжига и не образующих тугоплавкие димеры с залипшим 3’ концом. Синтез праймеров был осуществлен в Лаборатории органического синтеза РГП «Национальный центр биотехнологии». На основании результатов оптимизации условий постановки были разработаны протоколы выявления Mycoplasma spp. методом ПЦР с электрофоретической детекцией. Оценка специфичности протокола проводилась на коллекции образцов ДНК бактерий. С целью изучения видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с кератоконьюнктивитами КРС, были исследовано 110 проб от КРС семи хозяйств Акмолинской, Восточно-Казахстанской, Костанайской, Западно-Казахстанской, Павлодарской, Северо-Казахстанской областей, с разной степенью выраженности клинических признаков инфекционного кератоконьюнктивита КРС (ИИК). С целью изучения видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с маститами КРС были исследовано 32 пробы молока от КРС одного хозяйства Акмолинской областей с маститом на разных стадиях. Постановку ПЦР при оценке проводили по оптимизированным условиям, с использованием исходных праймеров. В результате секвенирования ДНК была определена видовая принадлежность микоплазм ассоциированных с ИИК и маститами КРС.

2022 г.

С целью изучения видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с кератоконьюнктивитами КРС, было исследовано 60 проб от КРС хозяйств Акмолинской, Костанайской, Восточно-Казахстанской областей, с клиническими признаками инфекционного кератоконьюнктивита КРС (ИИК). С целью изучения видового разнообразия Mycoplasma spp ассоциированных с маститами КРС было исследовано 20 проб молока от КРС хозяйства Акмолинской областей с маститом на разных стадиях. Постановку ПЦР при оценке проводили по оптимизированным условиям, с использованием исходных праймеров. В результате секвенирования ДНК была определена видовая принадлежность микоплазм ассоциированных с ИИК и маститами КРС