AP09258581 «Получение штамма клеток гибридом продуцирующие моноклональные антитела против внеклеточного фрагмента рецептора CTLA-4»

Основная идея проекта заключается в получении штамма мышиных гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против рекомбинантного фрагмента рецептора цитотоксического Т-лимфоцита (CTLA-4) человека. В соответствии с методологией получения гуманизированных антител, штаммы мышиных гибридом являются основой для разработки препаратов для таргетной терапии онкозаболеваний. Реализация проекта позволит в перспективе разработать отечественную технологию производства препаратов для таргетной терапии онкологических заболеваний.

Актуальность

Терапия онкологических болезней способом блокировки контрольных точек иммунной системы, в настоящее время приобретает широкое распространение. Полученные биологические активные молекулы, блокирующие контрольные точки иммунитета, применяются для разработки эффективных методов лечения и диагностики онкологических заболеваний, изучения функционирования иммунной системы в микроокружении опухолевых клеток. Рецептор PD-1 Т-лимфоцита является контрольной точкой сигнального пути, направленного на разрушение Т-лимфоцита, к которым относится и рецептор CTLA-4. Следовательно, моноклональные антитела к этим рецепторам Т-лимфоцита будут блокировать сигнальный путь и усиливать формирование иммунитета. Научная новизна проекта заключается в создании штамма продуцента рекомбинантного внеклеточного фрагмента CTLA-4 рецептора, получение моноклональных антител к более широкому спектру эпитопов CTLA-4 белка. В условиях in vitro и в экспериментальных моделях на лабораторных животных будет изучена возможность их использования для повышения противоопухолевого иммунитета. Полученные штаммы микроорганизмов продуценты рекомбинантного внеклеточного фрагмента CTLA-4 рецептора и анти-CTLA-4 моноклональные антитела будут способствовать дальнейшему расширению научных исследований по повышению противоопухолевого иммунитета. Штаммы продуценты анти-CTLA-4 моноклональных антител будут способствовать исследованиям по разработке гуманизированных моноклональных антител. Полученные штаммы продуценты также создают предпосылки для создания производства противоонкологических биопрепаратов.

Цель

Получение штаммов гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против внеклеточного фрагмента рецептора цитотоксического Т-лимфоцитаCTLA-4 человека.

Ожидаемые результаты

В результате проведенных исследований получен штамм микроорганизма, продуцирующий рекомбинантный внеклеточный фрагмент CTLA-4 рецептора человека. Получены штаммы клеток гибридом продуцирующие моноклональные антитела против внеклеточного фрагмента CTLA-4 рецептора человека и изучены иммунохимические свойства. Изучена противораковая активность анти-CTLA-4 моноклональных антител. Социальный, экономический, научно технический эффект заключается в создании платформы для производства высокотехнологичных отечественных биопрепаратов для повышения противоопухолевого иммунитета. Реализация проекта будет способствовать научному обоснованию использования рекомбинанантных белков и моноклональных антител для лечения онкологических заболеваний.

Руководитель проекта

Муканов Касым Касенович, руководитель проекта, доктор ветеринарных наук, профессор, h-индекс 3 (Author ID в Scopus – 56340590800).

Члены исследовательской группы

Боровиков С.Н., кандидат биологических наук, доцент. h-индекс 2, профиль (http://orcid.org/0000-0002-9721-9732).

Турсунов К.А., PhD, h-индекс 3 (Author ID Scopus -57193579180, Researcher ID Web of Science N-6319-2017).

Әдіш Ж., PhD докторант по специальности биологии, научный сотрудник НЦБ.

Каукабаева Г., магистр, младший научный сотрудник НЦБ.

Публикации и охранные документы по теме проекта

Sotnikov, D.V., Barshevskaya, L.V., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K.,Mukantayev, K.K., Ramankulov, Y.M., Dzantiev, B.B. Immunochromatographic system for serodiagnostics of cattle brucellosis using gold nanoparticles and signal amplification with quantum dots (2020) Applied Sciences (Switzerland), 10 (3), art. no. 738, . https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85081584093&doi=10.3390%2fapp 10030738&partnerID=40&md5= c18d312fdcd6eae186bafa 9cb8b8c62c. DOI: 10.3390/app10030738
Mukantayev, K., Kairova, Z., Tursunov, K., Shustov, A., Zhumabekova, S., Ramankulov, E., Mukanov, K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis (2019) Current Topics in Peptide and Protein Research, 20, pp. 41-49. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s0-85080894201&partnerID=40&md5=1337be9c346e87a8efb3f74e5062273b
Mukanov, K.K.,Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Tursunov, K.A., Kairova, Z.K., Kaukabayeva, G.K., Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V. Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor (2019) Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 27 (4), pp. 85-95. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85074484552&doi=10.35118%2fapjmbb.2019.027.4.10&partnerID=40&md5=bb97d2dd250cd7d2e68fcb7c8bf7faeb. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10
Sotnikov, D.V., Berlina, A.N., Zherdev, A.V., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K.,Ramankulov, Y.M., Mukantayev, K.N., Dzantiev, B.B. Immunochromatographicserodiagnosis of brucellosis in cattle using gold nanoparticles and quantum dots (2019) International Journal of Veterinary Science, 8 (1), pp. 28-34. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s0-85063189960&partnerID=40&md5=c9ba666b2eb9772380eff393ec05e6fd
Barshevskaya, L.V., Sotnikov, D.V., Zherdev, A.V., Khassenov, B.B., Baltin, K.K., Eskendirova, S.Z., Mukanov, K.K., Mukantayev, K.K., Dzantiev, B.B. Triple immunochromatographic system for simultaneous serodiagnosis of bovine brucellosis, tuberculosis, and leukemia (2019) Biosensors, 9 (4), art. no. 115. https://www.scopus.com/inward/record.uri?eid=2-s2.0-85072779454&doi=10.3390%2fbios 9040115&partnerID=40&md5=a8180d6dbd30827509d2ac8675c99751 DOI: 10.3390/bios90401152.
Sotnikov D.V., Byzova N.A., Zherdev A.V., Eskendirova S.Z., Baltin K.K., Mukanov K.K.,Ramankulov E.M.,Sadykhov E.G., Dzantiev B.B. Express immunochromatographic detection of antibodies against brucellaabortus in cattle sera based on quantitative photometric registration and modulated cut-off level. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, Issue 1, 2015; IF – 0,727.
Shevtsov, E. Ramanculov, E.Shevtsova, A.Kairzhanova, P.Tarlykov, M.Filipenko, M. Dymova, G. Abisheva, A.Jailbekova, D.Kamalova, A.Chsherbakov, S. Tulegenov, A. Akhmetova, I. Sytnik, T. Karibaev, K. Mukanov. Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infection, Genetics and Evolution 34 (2015) P.173-180. IF- 2,8.
Shevtsova, A. Shevtsov, K. Mukanov, M.Filipenko, D. Kamalova, I. Sytnik, M. Syzdykov, A Kuznetsov, A. Akhmetova, M. Zharova, T. Karibaev, P.Tarlykov, E. Ramanculov. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan.PLOSONE | DOI:10.1371/journal.pone.0167496 December 1, 2016, P.1-16. IF 3.54
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ15/3А — продуцент рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. Инновационный патент №25095. Мукантаев К.Н., Турсунов К., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Харлампиева Д.Д., Кущева Н.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм гибрид культивируемых клеток животных Mus Musculus L., продуцент моноклональных антител к ре-комбинантному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого ско-та. Авторское свиде-тельство №73446. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Белялова А.Р., Жылкибаев А.А., Балтин К.К., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN17 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN17. Авторское свидетельство №73335. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN47 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN47. Авторское свидетельство №73328. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TpN15 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TpN15. Авторское свидетельство №73314 1 Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/TprK — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum TprK. Авторское свидетельство №73307. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli В834/рЕТ32/Tp0453 — продуцент рекомбинантного мембранного липопротеина Treponema pallidum Tp0453. Авторское свидетельство №73321. Мукантаев К.Н., Бакирова Г.А., Лазарев В.Н., Левицкий С.А., Шкарупета М.М., Муканов К.К., Раманкулов Е.М.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 Asia продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа Азия. Авторское свидетельство №88014. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 О продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа О. Авторское свидетельство №88019. Муканов К.К., Раманкулов Е.М.,Шустов А.В.,Мукантаев К.Н., Байдосова Ш.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/pET32/VP1 А продуцент рекомбинантного VP1 антигена вируса ящура типа А. Авторское свидетельство №90924. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/Е3.pET22/gp51 продуцент рекомбинантного gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение №30998. Муканов К.К., Раманкулов Е.М., Шустов А.В., Мукантаев К.Н., Турсунов К., Бегалиева А.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/МPRV продуцент рекомбинантного матричного белка вируса бешенства. Удостоверение автора №106743. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К,А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32/NPRV продуцент рекомбинантного нуклеопротеина вируса бешенства. Удостоверение автора №101822. Мукантаев К.Н., Шустов А.В., Турсунов К,А., Інірбай Б., Әдіш Ж., Раманкулов Е.М., Муканов К.К.
Tursunov K., Begaliyeva A., Ingirbay B., Mukanov K., Ramanculov E., Shustov A., Mukantayev K. Cloning and expression of fragment of the rabies virus nucleoprotein gene in Escherichia coli and evaluation of antigenicity of the expression product//Iranian Journal of Veterinary Research. – 2017. –Vol.18, No. 1, Ser. No. 58, — P.36-42. PMID: 28588631.Q4. Цитирование
Bulashev, T. Jakubowski, K. Mukantayev, Tursunov, V. Kiyan, A. Zhumalin. Using combined recombinant protein in the diagnosis of bovine brucellosis//Med. Weter. 2018, 74 (3), 193-198. DOI: dx.doi.org/10.21521/mw.6079. Q3.
Kanatbek Mukantayev, Kanat Tursunov, Guljan Raimbek, Alexander Shustov, Asem Begaliyeva, Bakhytkali Ingirbay, Kasym Mukanov, Erlan Ramanculov. Immunochromatographic assay for diagnosis of bovine leukaemia virus infection in cows using the recombinant protein gp51//ISSN 1392-2130. VETERINARIJA IR ZOOTECHNIKA (Vet Med Zoot). T. 76 (98). 2018, p. 34-40. https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2018/76/pdf/mukantayev.pdf. Q4.
Mukantayev, K., Tursunov, B. Ingirbay, Z. Adish, M. Azhibayeva, Z. Kairova, E. Ramankulov, K. Mukanov and A. Shustov. Immunochromatographic assay for the foot-and-mouth disease utilizing recombinant nonstructural proteins 2C, 3A, 3B and 3D// Bulgarian Journal Agricultural Science, 2018, 24 (3): 489–496. https://www.agrojournal.org/24/03-21.html. Q4.
Mukantaev KN, Kairova Zh., Tursunov KA, Zhumabekova SH., Ramankulov EM, Mukanov K.K. Recombinant expression and purification of a pathogen-specific murein hydrolase lysin from γ-bacteriophage of Bacillus anthracis//Current Topics in Peptide and Protein Research. – 2019. – Vol.20. http://www.researchtrends.net/tia/article_pdf.asp?in=0&vn=20&tid=26&aid=6375. Q4.
Mukanov, K.K., Adish, Z.B., Mukantayev, K.N., Kulyyassov, A.T., Tarlykov, P.V.Recombinant expression and purification of adenocarcinoma gpr161 receptor//Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. -2019. 27(4), с. 85-95. DOI: 10.35118/apjmbb.2019.027.4.10. Q4.
Adish Zhansaya, Mukantayev Kanatbek, Tursunov Kanat, Ingirbay Bakhytkali, Kanayev Darkhan, Kulyyassov Arman, Tarlykov Pavel, Mukanov Kasym, Ramankulov Yerlan. Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor//Reports of Biochemistry & Molecular Biology.Vol.8, No.4, Jan 2020. http://rbmb.net/article-1-391-en.pdf3, Q3.
Bulashev, A., Jakubowski, T., Tursunov, K., Kiyan, V., & Zhumalin, A. (2018). Immunogenicity and antigenicity of Brucella recombinant outer membrane proteins. VeterinarijaIrZootechnika, 76(98), 17–24.
Borovikov S., Syzdykova A.,Scharmyschova M., Kiyan V. Thesynthesis of the immunoactive components of the Сampylobacter fetus antigen and the immunization of the laboratory animals for the purposes of synthesis of the specific antibodies. International Journal of Pharmacy & Technology IJPT.-2016.Vol. 8, 27097-27108 P.Q4.
Bulashev A.K., Borovikov S.N.,Serikova S.S., Suranshiev Z.A., Kiyan V.S., Eskendirova S.Z. 2016: Development of an ELISA using anti-idiotypic antibody for diagnosis of opisthorchiasis. Folia Parasitol. 63: 025; DOI:10.14411/fp.2016.025; Q3
Borovikov S., Aitmagambetova M. S. Results of cattle examination for campylobacteriosis using the polymerase chain reaction method. EEC – EM – Ecology, Environment and Conservation. VOL. 25 (1): 2019. –Р.456–459. (0971765X–India — Scopus) Q4.
Borovikov S.N. Оbtaining monoclonal antibodies to cardiac markers I & Т. Joint Conference: German Symposium on Zoonoses Research 2014 and 7th International Conference on Emerging Zoonoses. — Berlin, Germany, October 16-17, 2014.- С.82.
Инновационный патент № 30961 Республика Казахстан, МПКG01N 33/53, A61K 39/40. Штамм гибридных культивируемых клеток животных MusmusculusL. — используемый для получения моноклональных антител к препарату сердечного тропонина I. Боровиков С.Н., Куйбагаров М.А., Cыздыкова А.С., Картабаева Г.О.: заявитель и патентообладатель АО «Казахский агротех.унив-т им. С. Сейфуллина». опубл. 15.03. 2016, Бюл. № 3.

Достигнутые результаты

2021 г.

Проведен анализ аминокислотной и нуклеотидной последовательности рецептора CTLA4 человека. Отобран внеклеточный домен рецептора CTLA4 человека размером 125 аминокислотных остатков содержащий последовательность MYPPPYYLG. Разработана схема оптимизированной нуклеотидной последовательности гена рецептора для эффективной экспрессии в E.coli и олигонулеотидов для синтеза CTLA-4 в условиях de novo. Подобрана пара праймеров для амплификации гена рецептора CTLA-4 человека для экспрессии в P.pastoris. Разработаны схемы генетических конструкций на основе векторов рЕТ28, рЕТ32 и pPICZα несущие ген рецептора CTLA4 человека. В условиях de novo синтезирован и амплифицирован ген внеклеточного домена рецептора CTLA4 человека для бактериальной экспрессии. Получены экспрессионные вектора pET28/CTLA-4 и pET32/CTLA-4 и клетки кишечной палочки BL21 продуцирующие rCTLA-4 и rTrx/CTLA-4 белки. Отработаны условия экспрессии и очистки рекомбинантного внеклеточного домена CTLA-4 рецептора человека.

2022 г.

Изучены иммунохимические и иммунологические характеристики рекомбинантного rCTLA-4 белка. В результате анализа из наиболее вероятных белков, соответствующих совокупным спектрам МС/МС, наивысший балл (4950) соответствовал только одному CTLA-4 белку. Рекомбинантный rCTLA-4 белок с высокой степенью связывания реагировали с коммерческим препаратом рекомбинантного В7-1Fc белка. В результате гибридизации получены пять клонов (С9, А5, Н8, А4, Е9), продуцирующие антитела класса IgG и обладающие аффиностью от 2х10⁷М^-1 до 3х10⁸М^-1. Продуктивность гибридом составила in vitro от 20 до 30 мкг/мл, в условиях in vivo от 8 до 16 мг/мл. Методом аффинной хроматографии получены очищенные препараты моноклональных антител.

2023 г.

В реакции иммунофлуоресценции моноклональные антитела специфически реагировали с клеточной линий MCF-7. При обработке макрофагов rCTLA-4, rPD-L1 и rPD-1 белками ex vivo, с последующим внутрибрюшинным введением мышам, макрофаги активируют продукцию антител реагирующие с гомогенными рецепторами на раковых клетках. Результаты показали, что макрофаги процессируют белки в форме подходящие для распознавания Т- и В- клетками и активируют продукцию антител реагирующие с гомогенными рецепторами на раковых клетках. Анализ влияния концентрации белков при обработке макрофагов на титр антител у мышей, показал различие в результатах между rPD-1/rPD-L1 и rCTLA-4 белками. Отличие титров анти-rPD-1/анти-rPD-L1 антител у мышей было незначительным, несмотря на значительные различия концентрации белков в культуральной среде. В отличие от rPD-1/rPD-L1 белков, титр антител против rCTLA-4 сильно зависел от концентрации белка при обработке макрофага in vitro.