Актуальность

Интерфероны имеют длительную историю применения для лечения вирусных заболеваний в здравоохранении. В ветеринарной практике только начинается внедрение интерферонов для профилактики и лечения крупного рогатого скота, тем не менее, на рынке Казахстана уже существуют зарубежные препараты и сформировался спрос, который кратно возрастает в период сезонных инфекции или вспышек вирусных заболеваний. В связи с этим организация производства рекомбинантных ИФН является актуальной задачей для Казахстана. Любое производство биологических препаратов начинается с изыскательных работ. Предлагаемый проект является первым этапом в развитии отечественного производства рекомбинантных интерферонов для нужд животноводства. В рамках данного проекта будут получены 4 рекомбинантных ИФН крупного рогатого скота и оценена их антивирусная активность и изучены биологические свойства, будут депонированы штаммы-продуценты и оптимизированы методы производства рекомбинантных ИФН, изучена сохранность активности при хранении. В дальнейшем это позволит осуществить коммерциализацию технологии. В проекте имеется существенная научная новизна, потому что будет сделано сравнение биологических свойств разных интерферонов (разные подтипы ИФН I типа) в одинаковых условиях, что позволит определить какой ИФН наиболее эффективный для применения против определённых вирусов — возбудителей болезней КРС.

Цель проекта

Получение рекомбинантных интерферонов типа I (разных подтипов) крупного рогатого скота и изучение антивирусной активности против вирусов КРС.

Ожидаемые результаты

Основной идеей проекта является получение рекомбинантных интерферонов типа I (разных подтипов) крупного рогатого скота и сравнение их антивирусной активности против вирусов, вызывающих болезни КРС. В результате проекта будет получено не менее 4-х рекомбинантных интерферонов КРС I типа, для которых будут измерены специфические активности по ингибированию репликации вирусов КРС, что позволит выбрать наиболее эффективные рекомбинантные интерфероны для производства перспективных антивирусных ветеринарных препаратов. В процессе работы будут оптимизированы протоколы наработки, очистки и рефолдинга 4-х интерферонов, после чего наиболее активные субстанции и методы их получения будут использованы для коммерциализации технологии производства интерферонов КРС в Казахстане.

Руководитель проекта

Руководитель проекта

Каиржанова Алма Дуйсенбайкызы – 35 лет, PhD, научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Стаж научной работы 13 лет. Область научных интересов: молекулярная эпидемиология, разработка диагностических тест-систем, эпизоотология, микробиология, молекулярная биология, методы секвенирования нового поколения. Индекс Хирша = 2 (Scopus) основными задачами являются руководство проектом, подготовка отчетов, научных статей, дизайн экспериментов. 

https://www.webofscience.com/wos/author/record/2098064

https://orcid.org/0000-0002-9864-2700 —                         

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56737034300.

Сведения об основных публикациях научного руководителя проекта, касающихся темы Проекта

1. Kuibagarov M., Kairzhanova A., Vergnaud G., Amirgazin A., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Shevtsov A. Draft Genome Sequence of the Strain Francisella tularensis subsp. mediasiatica 240, Isolated in Kazakhstan // Microbiol. Resour. Announc. 2020 Aug 27;9(35):e00766-20. IF-0.7, CiteScore -1.5, https://doi.org/10.1128/mra.00766-20 Web of Science Q4.

2. Shevtsov V., Kairzhanova A.,Shevtsov A., Shustov A., Kalendar R., Abdrakhmanov S., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Vergnaud G. (2021) Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in Kazakhstan // PLoS Negl Trop Dis. 15(5):e0009419.   CiteScore -6.4,  IF- 3.4. doi: 10.1371/journal.pntd.0009419. Web of Science Q1.

3. Shevtsov A., Ramanculov E., Shevtsova E., Kairzhanova A., Tarlykov P., Filipenko M., Dymova M., Abisheva G., Jailbekova A., Kamalova D., Chsherbakov A., Tulegenov S., Akhmetova A., Sytnik I., Karibaev T., Mukanov K. Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16 // Infection, Genetics and Evolution 34 (2015): 173-180. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2015.07.008  IF-2.6. Web of Science Q1.

4. Shevtsov A., Izbanova U., Amirgazin A., Kairzhanova A., Dauletov A., Kiyan V., Vergnaud G. Genetic Homogeneity of Francisella tularensis subsp.mediasiatica strains in Kazakhstan//Pathogens. 2024 Jul 12;13(7):581. IF-2.6 https://doi.org/10.3390/pathogens13070581 Web of Science Q2.

Муканов Касым Касенович, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии». Стаж научной работы 45 года. Область научных интересов: вирусология, иммунология, изучение эпидемиологии инфекционных болезней и генетического разнообразия патогенов, разработка диагностических систем, эпизоотология и микробиология. В рамках проекта примет участие в создании штаммов микроорганизмов, продуцирующих рекомбинантные  интерфероны и отработке методов их очистки. Автор 23 статей в зарубежных изданиях с импакт-фактором, имеет 30 охранных документов на изобретения, индекс Хирша=7 (Scopus)

https://www.webofscience.com/wos/author/record/1371888

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56340590800

https://orcid.org/0000-0002-0502-9238.

Шевцов Александр Борисович,кандидат биологических наук, ассоциированный профессор, заведующий лабораторией прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии», стаж научной работы 22 года Область проводимых исследований: секвенирование по Сенгеру и с использованием секвенаторов нового поколения (NGS) Ion Torrent, MiSeq, MLVA типирование, клонирование, дизайн праймеров, ПЦР в реальном времени, биоинформатический анализ. В рамках проекта примет участие в биоинформационном анализе и подбор праймеров для ПЦР-амплификации гена интерферона, подготовке отчетов, научных статей, дизайне экспериментов. Индекс Хирша (Scopus)=10.

https://www.webofscience.com/wos/author/record/1632219

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57201604158

https://orcid.org/0000-0002-0307-1053.

Шустов Александр Вячеславович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией генетической инженерии ТОО «Национальный центр биотехнологии», стаж научной работы 32 года. Область проводимых исследований: генетическая инженерия микроорганизмов, вирусология, биоинженерия систем экспрессии в клетках млекопитающих и в бактериях, получения рекомбинантных белков. В рамках проекта примет участие в создании генетических конструкций содержащие ген интерферона КРС, оптимизации наработки и очистки рекомбинантного белка. Индекс Хирша (Scopus)=12.

https://www.webofscience.com/wos/author/record/430969

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57211989685

https://orcid.org/0000-0001-9880-9382.

Рыскельдина Анара Жанкожаевна, 28 лет, РhD докторант, младший научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 6 лет. Область проводимых исследований: изучение эпидемиологии инфекционных болезней и генетического разнообразия патогенов, секвенирование по Сенгеру, разработка диагностических тест-систем на основе ПЦР и ИФА, получение рекомбинантных белков. В рамках проекта примет участие в разработке протокола наработки, очистки и рефолдинга интерферонов крупного рогатого скота. Индекс Хирша (Scopus) =2.                         

https://www.webofscience.com/wos/author/record/56097356

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218871763

https://orcid.org/0000-0002-7100-2711.

Турсунбай Найля Ерланкызы, 24 года, магистр, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: изучение эпидемиологии инфекционных болезней, разработка методов ПЦР для диагностики кровепаразитарных и инфекционных болезней человека и животных. В рамках проекта примет участие в выделении и очистке целевых протеинов, получении субстанций исоздании оригинальных препаративных форм препаратов рекомбинантных интерферонов.

https://www.webofscience.com/wos/author/record/64038358

https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=59304069500

https://orcid.org/0000-0002-6604-4247.

Даулетов Аян Ерболатович, 23 года, магистр, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: изучение инфекционных болезней животных и их генетическое разнообразие, секвенирование по Сенгеру, разработка ПЦР тест – систем. В рамках проекта примет участие в наработке  и очистке целевого белка, постановка ИФА и вестрн-блота.

https://www.webofscience.com/wos/author/record/60852457

https://orcid.org/0000-0003-1906-6889.

Касен Амирхан Маулиулы, 23 года, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: генотипирование, секвенирование, изучение генетического разнообразия различных патогенов. В рамках проекта примет участие в колонировании целевых фрагментов, очистки и рефолдинге рекомбинантного белка.

https://www.webofscience.com/wos/author/record/50933821

https://orcid.org/0000-0002-8488-0863.

Публикации членов исследовательской группы

1. Shevtsov A, Lukhnova L, Izbanova U, Vernadet J.P, Kuibagarov M, Amirgazin A, Ramankulov Y, Vergnaud G. Bacillus anthracis Phylogeography: New Clues From Kazakhstan, Central Asia. Front Microbiol. 2021 Dec 8;12:778225.. PMID: 34956141; PMCID: PMC8692834. CiteScore Percentile — 84 (2021, Scopus); Web of Science Q1 (2021, WoS); DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225
2. Shevtsov A., Aushakhmetova Z., Amirgazin A., Khegay O., Kamalova D., Sanakulova B., Abdaliyev A., Bayesheva D., Seidullayeva A., Ramankulov Y., Shustov A., Vergnaud G. (2022). Whole genome sequence analysis of Neisseria meningitidis strains circulating in Kazakhstan, 2017–2018. Plos one, 17(12), e0279536. Percentile – 87, IF-3.7. Web of Science Q1. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0279536
3. Kuibagarov M., Abdullina E., Ryskeldina A., Abdigulov, B., Amirgazin, A., Shevtsov, A., & Angelos, J. A. (2023). Association of different microbes and pathogenic factors in cases of infectious bovine keratoconjunctivitis in cattle from Eastern Kazakhstan. Veterinary world, 16(9), 1833–1839. CiteScore- 3.6. Web of Science Q2.  https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.1833-1839
4. Shevtsov A., Cloeckaert A., Berdimuratova K., Shevtsova E., Shustov A. V., Amirgazin, A., Karibayev, T., Kamalova, D., Zygmunt, M. S., Ramanculov, Y., & Vergnaud, G. (2023). Brucella abortus in Kazakhstan, population structure and comparison with worldwide genetic diversity. Frontiers in microbiology, 14, 1106994. Scopus: 7.8 CiteScore- 7.7, percentile: 78. IF-4.0. Web of Science Q1 https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1106994
5. Abeev A., Zhylkibayev A., Kamalova D., Kusheva N., Nusupbaeva G., Tleumbetova N., Smagul M., Beissenova S., Aubakirova S., Kassenova Z., Demessinova B., Amanbayev A., Ramankulov Y., Shevtsov A. Epidemiological outbreaks of measles virus in Kazakhstan during 2015. Japanese journal of infectious diseases (2018): JJID-2017.  Scopus: 4.1 CiteScore -3.3, percentile: 51, Web of Science Q2 https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2017.565 
6. Ryskeldina A., Iskakova I., Sarina N., Shevtsov A., Syzdykova L., Shustov A., Ramankulov Y., Kuibagarov M (2022). Obtaining and use of the recombinant bovine pregnancy-associated glycoprotein 1. Adv. Anim. Vet. Sci. 10(10): 2148-2159. CiteScore -1.4. percentile: 47 Web of Science Q3. http://dx.doi.org/10.17582/journal.aavs/2022/10.
7.  Kuibagarov M., Zhylkibayev A., Kamalova D., Ryskeldina A., Yerzhanova N., Ramankulov Y., Shevtsov A., Angelos J.A (2022). Genetic diversity of pilin from kazakh isolates of Moraxella bovoculi. Adv. Anim. Vet. Sci. 10(11): 2376-2383. CiteScore -1.4. percentile: 47. Web of Science Q3. http://dx.doi.org/10.17582/journal.aavs/2022/10.
8.  Kadyrova M, Ostrovskii A, Mukanov K, Kassen A, Shevtsova E, Berdikulov M, Vergnaud G, Shevtsov A. Molecular Characterization of Anaplasma spp. in Cattle from Kazakhstan //Pathogens. – 2024. – 13(10):894. Web of Science Q2 https://doi.org/10.3390/pathogens13100894.   IF- 2.6
9. Ryskeldina A., Korobeinikov A., Tursunbay N., Berdikulov M., Shevtsov A., Bauer C., Mukhanbetkaliyev Y., and Kuibagarov M (2024) A novel recombinant Theileria annulata surface protein as an antigen in indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the serological diagnosis of tropical theileriosis, Veterinary World, 17(8): 1936–1942. CiteScore- 3.6. Web of Science Q2. DOI: 10.14202/vetworld.2024.1936-1942
10. Zhylkibayev A., Akishev, Zh., Khassenov B., Sarina N., Ramankulov Y., Mukanov K., Eskendirova S. Obtaining and characterization of a recombinant LipL32 protein for detection of leptospirosis //Tropical Biomedicine, 2018, Vol.35,  №1, P. 280-287, Web of Science Q4, https://www.cabidigitallibrary.org/doi/pdf/10.5555/20183277912
11. Syzdykova L.R., Binke S., Keyer V.V., Shevtsov A.B., Zaripov,M.M., Zhylkibayev A.A., Shustov A.V. (2021). Fluorescent tagging the NS1 protein in yellow fever virus: Replication-capable viruses which produce the secretory GFP-NS1 fusion protein. Virus Research, 294, 198291. CiteScore-9.5, IF-2.5, Percentile:75, Web of Science Q1. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198291
12. Kuibagarov M., Abdullina E., Ryskeldina A., Abdigulov B., Amirgazin A., Shevtsov A., Angelos J.A. Association of different microbes and pathogenic factors in cases of infectious bovine keratoconjunctivitis in cattle from Eastern Kazakhstan. Vet World. 2023 Sep;16(9):1833-1839. CiteScore- 3.6. Web of Science Q2. DOI: 10.14202/vetworld.2023.1833-1839
13. Kuibagarov M., Makhamed R., Zhylkibayev A., Berdikulov M., Abdrakhmanov .S, Kozhabayev M., Akhmetollayev I., Mukanov K., Ryskeldina A., Ramankulov Y., Shustov A., Bauer C., Shevtsov A. Theileria and Babesia infection in cattle — First molecular survey in Kazakhstan. Ticks Tick Borne Dis. 2023 Jan;14(1):102078. IF- 3.1 Web of Science Q1. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.102078
14. Kidiraliyev E.Z., Zhaksylykova A.A., Kydyrkhanova E.A., Kushaliyev K.Z., Shevtsov A.,  Ryskeldina A., Sembaeva Z.P., Arzybaev M.A., Budke C.M., Abdybekova A.M. Molecular evaluation of Eimeria spp. Infection in the Volga-Ural Saiga antelope population of the Republic of Kazakhstan. Int J Parasitol Parasites Wildl. 2024 Jul 16;24:100966. CiteScore- 3.8. IF-2.0. Web of Science Q2.  https://doi.org/10.1016/j.ijppaw.2024.100966
15.  Syzdykova L.,  Zauatbayeva G.,  Keyer  V.,  Ramanculov Y., Arsienko R.,  Shustov A., Process for production of chimeric antigen receptor-transducing lentivirus particles using infection with replicon particles containing self-replicating RNAs. Biochemical Engineering Journal. 2023. – Vol. 191. CiteScore- 6.3, Percentile:72. IF-3.7. Web of Science Q2.   https://doi.org/10.1016/j.bej.2023.108814
16. Keyer V., Syzdykova L., Zauatbayeva G., Zhulikeyeva A., Ramanculov Y., Shustov A., Shulgau Z. Tilorone and Cridanimod Protect Mice and Show Antiviral Activity in Rats despite Absence of the Interferon-Inducing Effect in Rats. Pharmaceuticals. 2022 May 17;15(5):617. CiteScore- 7.0, Percentile:69. IF-4.3. Web of Science Q1.  https://doi.org/10.3390/ph15050617
17. Amirgazin A., Shevtsov A., Karibayev T., Berdikulov M., Kozhakhmetova T., Syzdykova L., Ramankulov Y., Shustov A. Highly pathogenic avian influenza virus of the A/H5N8 subtype, clade 2.3.4.4b, caused outbreaks in Kazakhstan in 2020. PeerJ. 2022 Mar 2;10:e13038. CiteScore- 3.9, Percentile:78. IF-2.7. Web of Science Q2. https://peerj.com/articles/13038/

Достигнутые результаты

Составлены коллекции нуклеотидных последовательностей генов интерферонов I типа крупного рогатого скота, депонированных в международных базах генетической информации и конструирование in silico последовательностей для систем экспрессии в E.coli. В ходе работы была сформирована расширенная коллекция нуклеотидных последовательностей генов интерферонов I типа крупного рогатого скота, включающая представители всех основных подтипов IFN-α, IFN-β и IFN-τ.

Заказаны праймеры и химический синтез кодон-оптимизированных последовательностей генов интерферонов КРС I типа для 4-х разных подтипов интерферона. (IFN-αA, IFN-αC, IFN-β, IFN-τ) с добавлением рестрикционных сайтов и гексагистидинового (6×His) тега. Для проектирования праймеров целевой ген разбивали на перекрывающиеся олигонуклеотиды длиной 60 п.н. с перекрытием 16–20 п.н. при температуре отжига 50 °C ± 3 °C.

Проведено клонирование 4-х генов интерферонов КРС различных подтипов в плазмидный вектор pGEM-T с целью последующего секвенирования и подтверждения корректности их последовательностей. Клонирование выполняли с использованием системы pGEM-T Easy Vector System (Promega) в соответствии с инструкцией производителя. 

Приобретён препаративный хроматограф среднего давления SSG-P-300-C с системой Sepure Protein Purification System в пользовательской комплектации.

Созданы генно-инженерные конструкции для белковой экспрессии 4-х подтипов интерферона КРС в бактериальной системе экспрессии. Для получения экспрессионных конструкций использовали ранее секвенс-верифицированные клоны генов интерферонов КРС, клонированные в вектор pGEM-T. Из рекомбинантных плазмид pGEM-T::IFN-αA, pGEM-T::IFN-αC, pGEM-T::IFN-β и pGEM-T::IFN-τ целевые фрагменты вырезали с использованием соответствующих рестрикционных ферментов, фланкирующих область вставки.