Цель задачи

Цель проекта заключается в получении и изучении мио-инозитол-фосфогидролазы бациллярного происхождения и получение рекомбинантной термостабильной фитазы на её основе.

Актуальность

Фосфор является компонентом высокоэнергетических и низкоэнергетических фосфатов, нуклеиновых кислот, необходим для синтеза белка, фосфолипидов, метаболических ферментов и внутриклеточных буферов, обеспечивающих кислотно-основный баланс и поддерживающих минерализацию скелета. В растительных кормах, чаще всего являющихся основным источником белков, витаминов и минералов для сельскохозяйственных животных, около 60-90% фосфора содержится в виде фитиновой кислоты и ее солей – фитатов. Животные с однокамерным желудком (птицы, свиньи, рыбы) не способны к усвоению фитатов. Чтобы избежать дефицита фосфора у птиц и свиней фермеры используют фосфорсодержащие кормовые добавки, однако, это существенно увеличивает стоимость кормов и, соответственно, конечной продукции. В тоже время экскреция фитиновой кислоты и фитатов становится причиной загрязнения окружающей среды, в частности эвтрофикации. Фитиновая кислота, входящая в составы кормов, обладает антипитательными свойствами, так как отрицательно заряженные фитаты связывают катионы кальция, железа, марганца, цинка, калия и магния, тем самым снижая их биодоступность. Мио-инозитол-фосфогидролазы обладают фитазным действием катализируя гидролиз фитиновой кислоты и фитатов до монофосфата, что позволяет их использовать в качестве ферментной добавки в корма.

Научная новизна проекта заключается в получении и изучении новой мио-инозитол-фосфогидролазы, проведения генно-инженерных работ по сверхэкспрессии и оценки перспективности для применения в качестве фитатгидролизующего фермента. Практическая значимость проекта заключается в разработке технологии получения рекомбинантного термостабильного ферментного препарата фитазного действия для применения в кормовой промышленности и обладающего позитивным действием на экологию.

Практическая значимость заключается в разработке технологии получения рекомбинантного термостабильного ферментного препарата фитазного действия для применения в кормовой промышленности.

Ожидаемые результаты

В результате будет создана коллекция штаммов Bacillus с фитазной активностью, будут получены и изучены бациллярные мио-инозитол-фосфогидролазы. На основании результатов сравнительного анализа по биохимическим свойствам будет отобран наиболее перспективный фермент. С помощью генной инженерии будет получены рекомбинантный штамм-продуцент термостабильной мио-инозитол-фосфогидролазы. С использованием методов биотехнологии с помощью данного штамма-продуцента будет разработана технология получения рекомбинантной бациллярной фитазы. Будут определены условия выделения, очистки и получения сухой фитазы. В результате, на основе бациллярной мио-инозитол-фосфогидролазы будет получен биопрепарат фитазного действия для применения в кормопроизводстве.

Социально-экономический эффект заключается в развитии в Казахстане технологий получения рекомбинантных ферментов, имеющих высокую практическую значимость в промышленности и обладающего позитивным действием на экологию.

Руководитель проекта

Балтин Кайрат, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник. ResearcherID: AAQ-9372-2020, ORCID: 0000-0002-6187-7223, Scopus Author ID: 55437315200

Члены исследовательской группы

Хасенов Бекболат, кандидат химических наук, заведующий лабораторией. ResearcherID: AAM-8657-2020, ORCID: 0000-0003-4572-948X, Scopus Author ID: 36096620800

Актаева Сания, PhD, старший научный сотрудник. ResearcherID: AAR-5133-2020, ORCID: 0000-0001-6346-5866, Scopus Author ID: 57439359000

Мадуахасова Арина, магистрант Факультета естественных наук Евразийского национального университета имени Л.Н. Гумилева, лаборант, специализация – микробиология и биотехнология. ResearcherID: JNE-6827-2023, ORCID: 0009-0005-1460-0802

Астраханов Мағжан, лаборант. ResearcherID: JMP-6059-2023 ORCID: 0009-0005-4471-6072

Публикации и охранные документы по теме проекта

1. Aktayeva S., Baltin K., Kiribayeva A., Akishev Zh., Silayev D., Ramankulov Ye., Khassenov B. Isolation of Bacillus sp. A5.3 Strain with Keratinolytic Activity // Biology (MDPI). 2022, Vol 11, Issue 2, e244. https://doi.org/10.3390/biology11020244. Q1, Impact Factor 5.168, Cite Score 3.7, Percentile 71.
2. Akishev Zh., Aktayeva S., Kiribayeva A., Abdullaeva A., Baltin K., Mussakhmetov A., Tursunbekova A., Ramankulov Ye., Khassenov B. Obtaining of Recombinant
   Camel Chymosin and Testing Its Milk-Clotting Activity on Cow’s, Goat’s,
   Ewes’, Camel’s and Mare’s Milk // Biology (MDPI). 2022, Vol 11, Issue 11, e1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545. Q1, Impact Factor 5.168, Cite Score 3.7, Percentile 71.
3. Akishev Zh., Kiribayeva A, Mussakhmetov A, Baltin K., Ramankulov Ye., Khassenov B. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris // Heliyon. 2021. Volume 7, Issue 5, e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137. Q2, Impact Factor 3.776, Cite Score 5.5, Percentile 82.
4. Aktayeva S., Baltin K., Khassenov B. Isolation of Bacillus strains with eratinolytic activity // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2020, No 2.  P.95-99. https://doi.org/10.11134/btp.2.2020.11. РИНЦ 0.117.
5. Barshevskaya L.V., Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Khassenov B.B., Baltin K.K., Eskendirova S.Z., Mukanov K.K., Mukantayev K.K., Dzantiev B.B. Triple Immunochromatographic System for Simultaneous Serodiagnosis of Bovine Brucellosis, Tuberculosis, and Leukemia // Biosensors (Basel). 2019 Vol.9(4),115. Pp. 1-10. https://doi.org/10.3390/bios9040115. Q2, Impact Factor 5.972, Cite Score 5.6, Percentile 89.
6. Kiribayeva A., Mukanov B., Silayev D., Akishev Zh., Ramankulov Ye., Khassenov B. Cloning, expression, and characterization of a recombinant xylanase from Bacillus sp. T6 // PloS One. 2022. Vol.17(3). E0202232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202232. Q2, Impact Factor 4.069, Cite Score 5.5, Percentile 87.
7. Кириллов С.О., Абельденов С.К., Балтин К.К., Мусахметов А.С., Ли П.К., Силаев Д.В., Раманкулов Е.М., Хасенов Б.Б. Способ получения ферментной кормовой добавки фитазы // Патент Республики Казахстан №34593 от 25.09.2020.
8. Кириллов С., Абельденов С., Силаев Д., Хасенов Б. Рекомбинантный штамм Pichia pastoris X-33/appa, продуцирующий бактериальную фитазу AppA // Патент Республики Казахстан №32368 от 16.08.2017 г.
9. Kirillov S., Silaev D., Abeldenov S., Khassenov B. Heterologous extracellular expression of bacterial phytase (AppA) in Pichia pastoris and its biochemical characterization // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2016. Iss.4. pp. 36-44.
10.  Abeldenov S., Kirillov S., Kiribayeva A., Silayev D. Khassenov B. Expression, purification and biochemical characterization of recombinant phosphohydrolase AppA in Escherichia coli // Biotechnology. Theory and Practice. 2014. №3. Pp.61-65.
11. Matta E., Kiribayeva A., Khassenov B., Matkarimov B., Ishchenko A. Insight into DNA substrate specificity of PARP1-catalysed DNA poly(ADP-ribosyl)ation // Scientific Reports. 2020. Vol.10(1), 3699. Pp.1-11. https://doi.org/10.1038/s41598-020-60631-0. Q1, IF 4.38, CiteScore 7.1, Percentile 93.
12. Turgimbayeva A, Abeldenov S, Zharkov D.O, Ishchenko A.A, Ramankulov Y, Saparbaev M, Khassenov B. Characterization of biochemical properties of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from Helicobacter pylori // PloS One. 2018. Vol.13(8). E0202232. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202232. Q2, Impact Factor 4.069, Cite Score 5.5, Percentile 87.
13. Kalendar R., Khassenov B., Ramankulov Ye., Samuilova O., Ivanov K. Fast PCR: An in silico tool for fast primer and probe design and advanced sequence analysis // Genomics. 2017. Vol.109. pp. 312-319. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2017.05.005. Q2, Impact Factor 4.38, Cite Score 7.1, Percentile 58.
14. Abeldenov S., Talhaoui I., Zharkov D.O., Ishchenko A.A., Ramanculov E., Saparbaev M., Khassenov B. Characterization of DNA substrate specificities of apurinic/apyrimidinic endonucleases from Mycobacterium tuberculosis // DNA Repair. 2015, Vol. 33. Pp. 1-16. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2015.05.007. Q2, Impact Factor 4.821, Cite Score 7.0, Percentile 70.
15. Актаева С.А., Балтин К.К., Кирибаева А.К., Раманкулов Е.М., Хасенов Б.Б. Штамм бактерий Bacillus licheniformis T7 – продуцент протеаз и кератиназы Патент Республики Казахстан №35357 от 12.11.2021.
16. Aktayeva S., Baltin K., Ramankulov Ye., Khassenov B. Isolation and identification of the keratin degrading bacteria // Journal of Biotechnology. 2019. Vol.305S. P.S30. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2019.05.112. Q2, Impact Factor 4.122, Cite Score 6.2, Percentile 71.
17. Akishev Zh., Abdullaeva A., Khassenov B., Ramankulov Ye. Pilot-scale production of recombinant Camelus bactrianus chymosin B in Pichia (Komagataella) pastoris under constitutive GAP promoter // Journal of Biotechnology. 2018. Vol. 280S. P.S61. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.06.200. Q2, Impact Factor 4.122, Cite Score 6.2, Percentile 71.

Достигнутые результаты

2024

Выделены бактерии рода Bacillus из образцов почв, воды и ила. По результатам скрининга на селективных средах отобраны изоляты с фитазной активностью. Произведена видовая идентификация штаммов с фитазной активностью с использованием молекулярно-генетических и протеомных методов. По полученным данным штаммы были идентифицированы как Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis и Bacillus paralicheniformis. Идентификация бациллярных мио-инозитол-фосфогидролаз проводилась методом масс-спектрометрии и протеомики.