Актуальность

Пироплазмозы крупного рогатого скота оказывают большое негативное экономическое влияние из-за потери продуктивности, падежа животных, затрат на борьбу с клещами, выявления болезни профилактику и лечение. Кроме того, пироплазмозы является сдерживающим фактором интенсификации животноводства высокопродуктивным скотом, так как завезенный в неблагополучный регион высокопродуктивный скот при заражении переболевает в тяжелой острой форме с высоким уровнем смертности и потерей продуктивности, тогда как аборигенный скот более устойчив к заболеванию и переболевает в более легкой форме.

Бабезиоз (пираплазмоз) переносимая клещами инфекция, вызываемые простейшими паразитами рода Babesia, отряда Piroplasmida, семейства Babesiidae. Представители рода Babesia исторически имели эволюционный успех, благодаря чему в настоящее время идентифицировано более 100 видов Babesia spp у млекопитающих и птиц. У крупных жвачных животных выявляют: Babesia bovis , Babesia bigemina , Babesia occultans , Babesia divergens , Babesia ovata , Babesia odocoilei и Babesia capreoli. Бабезиоз крупного рогатого скота, вызываемый B.bovis и B. bigemina — острое и стойкое заболевание, характеризующееся высокой смертностью. Животные, пережившие острую инфекцию, становятся длительными бессимптомными носителями паразитов. Таким образом, персистентно инфицированные животные являются постоянным источником передачи инфекции клещами и поддержания коллективного иммунитета. Cчитается, чтопо сравнению с B. bovis, вирулентность B. bigemina ниже, однако, инфекция вызываема B. Bigemina также может привести к серьезным экономическим потерям в животноводстве.

Цель

Целью проекта является определение и синтез иммунодоминантных антигенов Babesia bigemina и разработка на их основе ИФА тест-системы для серологической диагностики бабезиоза КРС.

Ожидаемые результаты

Идея заключается в изучение иммунодоминантных протеинов Babesia bigemina и определение их диагностической ценности в ИФА. Для этой цели будут получены рекомбинантные антигены описные в литературе, а также идентифицированные новые протеины, потенциально обладающие диагностической ценностью, определение которых будет осуществлено методами «обратной вакцинологии». Для белков-кандидатов будут получены рекомбинантные аналоги, специфичность которых будет определена в ИФА и Western Blotting. На основе отобранных специфичных антигенов будет разработана тест-система ИФА. Широкое применение разработки при диагностике бабезиоза, будет способствовать своевременному и оперативному выявлению инфицированного скота, положительно скажется на повышении продуктивности и предотвратит распространение заболевания в новые регионы.  Предлагаемая схема исследования соответствует междисциплинарному подходу, обеспечивающему сотрудничество между широкими научными направлениями – ветеринарией, биоинформатикой, молекулярной биологией и иммунологией.

Руководитель проекта

Куйбагаров Марат Амангельдыевич, 49 лет, кандидат ветеринарных наук, главный научный сотрудник лабораторий прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии». Стажировался в исследовательских центрах Германии, США. Область научных интересов: молекулярная биология, геномные технологии, разработка ПЦР и ИФА тест-систем, генетическая инженерия. Стаж научной работы 20 лет. Индекс Хирша по Scopus/WoS =3. В рамках подаваемого проекта осуществляет общее руководство проектом, принимает участие в оптимизации параметров ИФА, интерпретации и анализе полученных результатов, подготовке научно-технической документации.
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57220278412
https://orcid.org/0000-0001-7428-7620

Сведения об основных публикациях научного руководителя проекта, касающихся темы Проекта

1. Marat Kuibagarov, Riza Makhamed, Assylbek Zhylkibayev, Maxat Berdikulov, Sarsenbay Abdrakhmanov, Mazhit Kozhabayev, Ilyas Akhmetollayev, Kasim Mukanov, Anara Ryskeldina, Yerlan Ramankulov, Alexandr Shustov, Christian Bauer, Alexandr Shevtsov. Theileria and Babesia infection in cattle – first molecular survey in Kazakhstan. Ticks and Tick-borne Diseases. 2023., Vol.4, Issue 1. 102078,ISSN 1877-959X, Q2 (2021, WoS) https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.102078
2. Shevtsov A, Lukhnova L, Izbanova U, Vernadet JP, Kuibagarov M, Amirgazin A, Ramankulov Y, Vergnaud G. Bacillus anthracis Phylogeography: New Clues From Kazakhstan, Central Asia. Front Microbiol. 2021 Dec 8;12:778225.. PMID: 34956141; PMCID: PMC8692834. CiteScore Percentile — 84 (2021, Scopus); Q1 (2021, WoS); DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225
3. Bauer, C., Kuibagarov, M., Lider, L. A., Seitkamzina, D. M., & Suranshiyev, Z. A. (2023). Bovine hypodermosis is highly prevalent in Kazakhstan: Results of a first serological study. Veterinary world, 16(6), 1289–1292. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.1289-1292
4. Kuibagarov M.A., Makhamed R., Lider L.A., Abdrakhmanov S.K., Shevtsov A.B. Optimization of PCR protocol to identify Theileria annulata //Eurasian Journal of Applied Biotechnology. — 2019. — №2. — Р.84-90  https://doi.org/10.11134/btp.2.2019.8
5. Рыскельдина А. Ж., Коробейников А. А., Кадырова М. Е., Камалова Д. К., Муханбеткалиев Е. Е., Куйбагаров М. А., Шевцов А. Б. Theileria annulata-ның рекомбинантты протеинін алу және оның диагностикалық құндылығын анықтау [Текст] / Наука и образование. — 2023. — №2-1 (71). — С. 46-56. https://doi.org/10.52578/2305-9397-2023-2-1-46-56
6. «Способ выявления Theileria annulata методом полимеразной цепной реакции». Патент РК на изобретение №35391, 26/11/2021. Куйбагаров М.А., Камалова Д.К., Махамед Р. Шевцов А.Б., Раманкулов Е.М.

Муканов Касым Касенович – 69 лет, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии», стаж научной работы 43 года. Индекс Хирша по Scopus/WoS=7. Имеет опыт работы по разработке диагностических тест систем на основе ИФА, ИХА и ПЦР, получению моноклональных антител, молекулярно-генетической характеристике возбудителей инфекционных болезней. Область научных интересов: иммунология, разработка диагностических систем, эпизоотология, вирусология и микробиология. В рамках выполнения проекта будет осуществлять работу по идентификации генов, постановке ПЦР и ИФА, получению рекомбинантных антигенов, разработке лабораторного регламента.
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56340590800
https://orcid.org/0000-0002-0502-9238

Шевцов Александр Борисович, 42 года,кандидат биологических наук, заведующий лабораторией прикладной генетики ТОО «Национальный центр биотехнологии», стаж научной работы 16 лет. Индекс Хирша по Scopus/WoS=11. Область научных интересов: ПЦР, секвенирование по Сенгеру и с использованием секвенаторов нового поколения (NGS) Ion Torrent, MiSeq, MLVA типирование, клонирование, дизайн праймеров. В рамках выполнения проекта будет осуществлять работу по идентификации генов, секвенировании, дизайне праймеров, постановке ПЦР и RT-PCR, по биоинформационному анализу, получении рекомбинантных протеинов.
http://orcid.org/0000-0002-0307-1053
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57201604158

Амиргазин Асылулан Оразгалиевич, 31 год, научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 6 лет, индекс Хирша (Scopus) =4.  Область проводимых исследований: секвенирование по Сенгеру, NGS, ПЦР в реальном времени, биоинформатический анализ. В рамках проекта принимает участие в биоинформационном анализе с использованием методов обратной вакцинологии, секвенировании, культивировании рекомбинантных штаммов, выделении и очистке целевых протеинов.
https://orcid.org/0000-0001-9418-7758
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218628470

Рыскельдина Анара Жанкожаевна, 27 лет, phD докторант, младший научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 5 лет, индекс Хирша (Scopus) =2. Область проводимых исследований: секвенирования по Сенгеру, ПЦР в реальном времени, ИФА. В рамках проекта она принимает участие в клонировании (pGEM-T), секвенировании, культивировании рекомбинантных штаммов, выделении и очистке целевых протеинов, постановке ИФА.
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=57218871763
https://orcid.org/0000-0002-7100-2711

Даулетов Аян Ерболатович, 22 года, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: ПЦР, ИФА, Western blot. В рамках проекта принимает участие в выделении и очистке целевых протеинов, постановке ИФА, Western blot, SDS-PAGE, приготовление растворов реагентов.
https://orcid.org/0000-0003-1906-6889

Основные публикации

1. Wagner E, Shin A, Tukhanova N, Turebekov N, Nurmakhanov T, Sutyagin V, Berdibekov A, Maikanov N, Lezdinsh I, Shapiyeva Z, Shevtsov A, Freimüller K, Peintner L, Ehrhardt C, Essbauer S. First Indications of Omsk Haemorrhagic Fever Virus beyond Russia. Viruses. 2022 Apr 4;14(4):754. DOI: 10.3390/v14040754
2. Wagner E, Tukhanova N, Shin A, Turebekov N, Shapiyeva Z, Shevtsov A, Nurmakhanov T, Sutyagin V, Berdibekov A, Maikanov N, Lezdinsh I, Freimüller K, Ehmann R, Ehrhardt C, Essbauer S, Peintner L. Incidence of tick-borne spotted fever group Rickettsia species in rodents in two regions in Kazakhstan. Sci Rep. 2022 Sep 1;12(1):14872. DOI: 10.1038/s41598-022-19145-0
3. Amirgazin A, Shevtsov A, Karibayev T, Berdikulov M, Kozhakhmetova T, Syzdykova L, Ramankulov Y, Shustov AV. Highly pathogenic avian influenza virus of the A/H5N8 subtype, clade 2.3.4.4b, caused outbreaks in Kazakhstan in 2020. PeerJ. 2022 Mar 2;10:e13038. PMID: 35256921; PMCID: PMC8898005.  DOI: 10.7717/peerj.13038
4. Shevtsov A, Lukhnova L, Izbanova U, Vernadet JP, Kuibagarov M, Amirgazin A, Ramankulov Y, Vergnaud G. Bacillus anthracis Phylogeography: New Clues From Kazakhstan, Central Asia. Front Microbiol. 2021 Dec 8;12:778225.. PMID: 34956141; PMCID: PMC8692834. CiteScore Percentile — 84 (2021, Scopus); Q1 (2021, WoS); DOI: 10.3389/fmicb.2021.778225
5. Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A, Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. Epidemiology of Brucellosis and Genetic Diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLOS ONE | December 1, 2016, P.1-16. IF-3.54. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167496
6. Mukantayev, K., Kanayev, D., Zhumabekova, S., Shevtsov, A., Tursunov, K., Mukanov, K., & Ramankulov, Y. (2022). Optimization of polymerase chain reaction for the identification of Roe deer, Saiga, and Siberian stag living in Kazakhstan. Veterinary world, 15(8), 2067–2071. https://doi.org/10.14202/vetworld.2022.2067-2071
7. Shevtsov, A., Cloeckaert, A., Berdimuratova, K., Shevtsova, E., Shustov, A. V., Amirgazin, A., Karibayev, T., Kamalova, D., Zygmunt, M. S., Ramanculov, Y., & Vergnaud, G. (2023). Brucella abortus in Kazakhstan, population structure and comparison with worldwide genetic diversity. Frontiers in microbiology, 14, 1106994. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1106994 Scopus: 7.8 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 78.
8. Issabek AU, Orynbayev MB, Sultankulova KT, Amirgazin A, Zakarya KD, Omarova Z, Chervyakova OV. Genome Sequence of Atyrau-5BJN(IL18), a Recombinant Lumpy Skin Disease Virus with Knockout of Virulence Genes. Microbiol Resour Announc. 2022 Jul 21;11(7):e0038022. doi: 10.1128/mra.00380-22. Epub 2022 Jun 21. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.
9. Klivleyeva NG, Ongarbayeva NS, Korotetskiy IS, Glebova TI, Saktaganov NT, Shamenova MG, Baimakhanova BB, Shevtsov AB, Amirgazin A, Berezin VE, Webby RJ. Coding-Complete Genome Sequence of Swine Influenza Virus Isolate A/Swine/Karaganda/04/2020 (H1N1) from Kazakhstan. Microbiol Resour Announc. 2021 Sep 30;10(39):e0078621. doi: 10.1128/MRA.00786-21. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.
10. Zholdybayeva E, Kozhahmetova S, Tarlykov P, Atavliyeva S, Mukhtarova K, Syzdykov T, Khasenov R, Shevtsov A, Amirgazin A, Daniyarov A, Ramankulov Y. Analysis of Bacteroides fragilis Clinical Strains Isolated in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc. 2021 Feb 4;10(5):e01311-20. doi: 10.1128/MRA.01311-20. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.
11. Amirgazin A, Vergnaud G, Mukanov K, Kuibagarov M, Karibaev T, Ramankulov Y, Shevtsov A. Draft Genome Sequences of Three Pasteurella multocida Strains Isolated from Domestic Animals in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc. 2020 Aug 6;9(32):e00487-20. doi: 10.1128/MRA.00487-20. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.
12. Kuibagarov M, Amirgazin A, Vergnaud G, Shustov A, Ryskeldina A, Ramankulov Y, Shevtsov A. Draft Genome Sequence of Moraxella bovoculi Strain KZ-1, Isolated from Cattle in North Kazakhstan. Microbiol Resour Announc. 2020 Jul 23;9(30):e00670-20. doi: 10.1128/MRA.00670-20. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.

Достигнутые результаты

Проведено тестирование проб коллекции ДНК, выделенной из цельной крови от крупного рогатого скота, с использованием универсальных праймеров подобраных на рибосомальный оперон Babesia spp и Theileria spp. Для определения видового разнообразия, проведено секвенирования фрагмента 18S rRNA гена в позитивных по результатам ПЦР пробах. Результаты показали, что наибольший процент инфицированного  Theileria spp и Babesia spp КРС установлен в двух южных областях Казахстана (Жамбылская и Туркестанская). Были идентифицированы два вида тейлерий: T. annulata и T. orientalis, а также три вида бабезий (B. bigemina, B. occultans, B. major).

С целью определения диагностически перспективных антигенов, проведен анализ протеомов B.bigemina. Был проведен биоинформатический анализ предсказанных белков с использованием методов обратной вакцинологии (in silico). Проведен анализ генома B.bigemina, определены открытые рамки считывания белков, вычислены прогностически доступные для иммунной системы белки. Проведен анализ консервативности генов выбранных белков для патогенных видов Babesia. Определены стратегия и методы клонирования выбранных кандидатов(системы экспрессии, векторы, условия культивирования и очистки). Проведена амплификация/синтез de novo нуклеотидных последовательностей двух идентифицированных in silico протеинов.

Проведена амплификация/синтез de novo нуклеотидных последовательностей генов диагностически перспективных протеинов B.bigemina описанных в литературе. Для получения белка AMA-1 проведен синтез синтез de novo участков эктодоменов I и II. Для получения антигенов RAP-1 проведена амплификация участка С-концевого фрагмента.