Актуальность

Бабезиоз — переносимая клещами инфекция, вызываемые простейшими паразитами рода Babesia, отряда Piroplasmida, семейства Babesiidae. Представители рода Babesia исторически имели эволюционный успех, благодаря чему в настоящее время идентифицировано более 100 видов Babesia spp у млекопитающих и птиц. Бабезиоз крупного рогатого скота — острое и стойкое заболевание, характеризующееся высокой смертностью. У крупных жвачных животных  выявляют: Babesia bovis (B.bovis) , Babesia bigemina (B. bigemina) , Babesia occultans, Babesia divergens, Babesia ovata, Babesia odocoilei и Babesia capreoli .  Описывается бабезиоз буйволов в Китае, вызываемый видом Babesia orientalis. Наиболее часто регистрируемыми видами, выявляемыми у КРС при бабезиозе являются B.bovis и  B.bigemina. Животные, пережившие острую инфекцию, становятся длительными бессимптомными носителями паразитов. Таким образом, персистентно инфицированные животные являются постоянным источником передачи инфекции клещами и поддержания коллективного иммунитета. Одним из традиционных методов диагностики бабезиоза является микроскопия окрашенных мазков крови, с целью обнаружения мерозоитов возбудителя. Это достаточно простой в исполнении тест, позволяющий выявлять острые случаи инфекции, однако имеющий ограниченное применение при низком уровне паразитемии. Также возможны сложности при дифференциации бабезий по морфологическим признакам от других видов гемоспоридий.

Цель проекта

Целью проекта является изучение видового разнообразия Babesia spp на территории Казахстана и разработка ПЦР тест-системы для дифференциальной диагностики бабезиозов КРС

Ожидаемые результаты

Идея заключается в изучение видового разнообразия Babesia spp на территории Казахстана и разработке ПЦР тест-системы для диагностики бабезиоза КРС. С целью получения актуальных данных по видовому составу бабезий, будет проведено тестирование выборки проб ДНК из цельной крови КРС и суспензий клещей из различных регионов Казахстана. На установленные виды бабезий будут подобраны праймеры флуоресцентные зонды и оптимизированы условия ПЦР реакции. Отработанные условия будут основой для лабораторного прототипа ПЦР тест-системы выявления и дифференциации бабезиозов КРС методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени. На финальной стадии будет проведена оценка чувствительности и специфичности разработанного лабораторно прототипа ПЦР тест-системы и разработан лабораторный регламент для последующего внедрения.

Руководитель проекта

Ахметова Асель Еркиновна — руководитель проекта, 32 года, PhD, старший научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Индекс Хирша = 4 (Scopus). Стаж научной работы 9 лет. Область научных интересов: молекулярная эпидемиология, разработка диагностических тест-систем, эпизоотология, микробиология, молекулярная биология, применение методов секвенирования нового поколения. В рамках проекта осуществляет общее руководство. Участвует в определении дизайна экспериментов, разработке ПЦР протоколов,  подготовке необходимых отчетов и научных публикаций по результатам исследований.
https://orcid.org/0000-0003-2206-7890
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56736565400

Сведения об основных публикациях научного руководителя проекта, касающихся темы Проекта

1. Akhmetova, A., Guerrero, J., McAdam, P., Salvador, L. C. M., Crispell, J., Lavery, J., Presho, E., Kao, R. R., Biek, R., Menzies, F., Trimble, N., Harwood, R., Pepler, P. T., Oravcova, K., Graham, J., Skuce, R., du Plessis, L., Thompson, S., Wright, L., Byrne, A. W.Allen, A. R. (2023). Genomic epidemiology of Mycobacterium bovis infection in sympatric badger and cattle populations in Northern Ireland. Microb Genom, 9(5). doi:10.1099/mgen.0.001023 Web of Science: Q2; Scopus: 6.0 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 69.
2. Shevtsov A., Ramanculov E., Shevtsova E., Kairzhanova A., Tarlykov P., Filipenko M., Dymova M., Abisheva G., Jailbekova A., Kamalova D., Chsherbakov A., Tulegenov S., Akhmetova A., Sytnik I., Karibaev T., Mukanov K. (2015). Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infect Genet Evol, (34) 173-80 DOI: 10.1016/j.meegid.2015.07.008 Web of Science: Q3; Scopus: 7.5 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 89.
3. Shevtsova E., Shevtsov A., Mukanov K., Filipenko M., Kamalova D., Sytnik I., Syzdykov M., Kuznetsov A., Akhmetova A., Zharova M., Karibaev T., Tarlykov P., Ramanculov E. (2016). Epidemiology of Brucellosis and Genetic diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLoS ONE, 11 (12). DOI10.1371/journal.pone.0167496 Web of Science: Q2; Scopus: 6.0 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 87.
4. De Nardi, M., Léger, A., Stepanyan, T., Khachatryan, B., Karibayev, T., Sytnik, I., Tyulegenov, S., Akhmetova, A., Nychyk, S., Sytiuk, M., Nevolko, O., Datsenko, R., Chaligava, T., Avaliani, L., Parkadze, O., Ninidze, L., Kartskhia, N., Napetvaridze, T., Asanishvili, Z., Khelaia, D., Menteshashvili, I., Zadayan, M., Niazyan, L., Mykhaylovska, N., Brooks, B. R., Zhumabayeva, G., Satabayeva, S., Metreveli, M., Gallagher, T. & Obiso, R. (2017). Implementation of a Regional Training Program on African Swine Fever As Part of the Cooperative Biological Engagement Program across the Caucasus Region. Front Vet Sci, 4, 164. DOI10.3389/fvets.2017.00164 Web of Science: Q1; Scopus: 3.8 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 84.
5. Crispell, J., Benton, C. H., Balaz, D., De Maio, N., Ahkmetova, A., Allen, A., Biek, R., Presho, E. L., Dale, J., Hewinson, G., Lycett, S. J., Nunez-Garcia, J., Skuce, R. A., Trewby, H., Wilson, D. J., Zadoks, R. N., Delahay, R. J., Kao, R. R. (2019). Combining genomics and epidemiology to analyse bi-directional transmission of Mycobacterium bovis in a multi-host system. eLife, 8, e45833. https://doi.org/10.7554/eLife.45833 Web of Science: Q1; Scopus: 12.3 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 89.

Камалова Динара Камаловна – 36 лет, магистр, PhD докторант, научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Индекс Хирша=3 (Scopus).  Стаж научных исследований 10 лет. Область научных интересов: разработка диагностических тест-систем для диагностики инфекционных болезней, генотипирование методом MLVA и MLST. В рамках проекта участвует в разработке ПЦР тест-систем и идентификации генов, дизайне праймеров, постановке ПЦР и секвенировании.
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56736413900
Kamalova D (0000-0002-8444-3305) — ORCID

Каиржанова Алма Дуйсенбайқызы – 34 года, PhD докторант, научный сотрудник лаборатории прикладной генетики НЦБ. Индекс Хирша (Scopus) = 2.Стаж научных исследований 12 лет. Область проводимых исследований: разработка ПЦР для диагностики кровепаразитарных заболеваний, секвенирование. В рамках проекта участвует в  разработке ПЦР протоколов, проведении оценки специфичности и чувствительности ПЦР тест-систем в режиме реального времени.
https://orcid.org/0000-0002-9864-2700
https://www.scopus.com/authid/detail.uri?authorId=56737034300).

Кадырова Мадина Есенбаевна — 25 лет, магистрант, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ.  Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разработка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера. В рамках проекта участвует в  выделение ДНК, исследовании образцов, взятых от крупного и мелкого рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени, постановка горизонтального электрофореза, очистка ПЦР продуктов
https://orcid.org/0000-0002-9079-8743

Тұрсұнбай Найля Ерланқызы — 23 года, магистрант, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 2 года. Область проводимых исследований: выделение нуклеиновых кислот, разрабтка ПЦР, секвенирование методом Сэнгера. В рамках проекта участвует в  постановке  ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, очистке ПЦР продуктов, секвенирование.
https://orcid.org/0000-0002-6604-4247

Островский Александр Сергеевич, 23 года, магистрант, лаборант лаборатории прикладной генетики НЦБ. Опыт научной работы 1 год. Область проводимых исследований: разработка ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний, оценка эффективности тест-систем. В рамках проекта участвует в  постановке  ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, очистке ПЦР продуктов, секвенирование.
https://orcid.org/0009-0006-8139-8285

Публикации членов исследовательской группы

1. Abeev, A., Zhylkibayev, A., Kamalova, D., Kusheva, N., Nusupbaeva, G., Tleumbetova, N., Smagul, M., Beissenova, S., Aubakirova, S., Kassenova, Z., Demessinova, B., Amanbayev, A., Ramankulov, Y., Shevtsov, A. Epidemiological outbreaks of measles virus in Kazakhstan during 2015. Japanese journal of infectious diseases (2018): JJID-2017. https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2017.565 Scopus: 4.1 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 51
2. Shevtsova, E., Shevtsov, A., Mukanov, K., Filipenko, M., Kamalova, D., Sytnik, I., Syzdykov, M., Kuznetsov, A., Akhmetova, A., Zharova, M., Karibaev, T., Tarlykov, P., Ramanculov, E. Epidemiology of brucellosis and genetic diversity of Brucella abortus in Kazakhstan. PLoS One 11.12 (2016):e0167496.  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167496 Scopus: 6.0 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 87.
3. Shevtsov, A., Ramanculov, E., Shevtsova, E., Kairzhanova, A., Tarlykov, P., Filipenko, M., Dymova, M., Abisheva, G., Jailbekova, A., Kamalova, D., Chsherbakov, A., Tulegenov, S., Akhmetova, A., Sytnik, I., Karibaev, T., Mukanov, K. Genetic diversity of Brucella abortus and Brucella melitensis in Kazakhstan using MLVA-16. Infection, Genetics and Evolution 34 (2015): 173-180. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2015.07.008 Scopus: 7.5 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 89.
4. Kuibagarov, M., Zhylkibayev, A., Kamalova, D., Ryskeldina, A., Yerzhanova, N., Ramankulov, Y., et.all & Angelos, J. A. (2022). Genetic diversity of pilin from kazakh isolates of moraxella bovoculi. Adv. Anim. Vet. Sci, 10(11), 2376-2383. Scopus: 1.3 Cite score 2022; CiteScore percentile: 43.
5. Shevtsov, A., Aushakhmetova, Z., Amirgazin, A., Khegay, O., Kamalova, D., Sanakulova, B., Abdaliyev,A . Bayesheva, D.Seidullayeva, A .  Ramankulov, Y. (2022). Whole genome sequence analysis of Neisseria meningitidis strains circulating in Kazakhstan, 2017–2018. PLoS One, 17(12), e0279536. Web of Science Q1. Scopus: 6.0 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 87.
6. Kuibagarov, M., Zhylkibayev, A., Kamalova, D., Ryskeldina, A., Yerzhanova, N., Ramankulov, Y., Angelos, J. (2022). Genetic diversity of pilin from kazakh isolates of moraxella bovoculi. Adv. Anim. Vet. Sci, 10(11), 2376-2383.Scopus: 1.3 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 43.
7. Shevtsov V., Kairzhanova A., Shevtsov A., Shustov A., Kalendar R., Abdrakhmanov S., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Vergnaud G. Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in Kazakhstan. PLoS Negl Trop Dis. 2021 May 17; 15(5):e0009419. doi: 10.1371/journal.pntd.0009419. Scopus: 7.2 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 88.
8. Kuibagarov M., Kairzhanova A., Vergnaud G., Amirgazin A., Lukhnova L., Izbanova U., Ramankulov Y., Shevtsov A. Draft Genome Sequence of the Strain Francisella tularensis subsp. mediasiatica 240, Isolated in Kazakhstan. Microbiol Resour Announc. 2020 Aug 27; 9(35):e00766-20. doi: 10.1128/MRA.00766-20. Scopus: 1.6 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 39.
9. Shevtsov, A., Cloeckaert, A., Berdimuratova, K., Shevtsova, E., Shustov, A. V., Amirgazin, A., Karibayev, T., Kamalova, D., Zygmunt, M. S., Ramanculov, Y., & Vergnaud, G. (2023). Brucella abortus in Kazakhstan, population structure and comparison with worldwide genetic diversity. Frontiers in microbiology, 14, 1106994. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1106994 Scopus: 7.8 CiteScore 2022; CiteScore percentile: 78.
10. Shevtsov A.B., Lutsay V.B., Kairzhanova A.D.,Lukhnova L.Yu., Kulatay T. Zh., Izbanova U.A., Karibaev T.B., Shustov A.V. Optimization of genotyping protocol for B. antracis using multiple-locus VNTR analisis MLVA-31 // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. – 2019. –№2. – P.103-113.

Достигнутые результаты

Проведено ПЦР тестирование 7000 проб ДНК выделенной из цельной крови КРС на наличие ДНК паразитов рода Babesia spp. ПЦР тестирование проводили с использованием универсальных праймеров подобранных к роду Babesia spp. Видовая принадлежность установлена методом прямого секвенирования. Установлено, что наиболее распространенными видами бабезии являются: Babesia bigemina, Babesia major, Babesia occultans.

Проведен подбор праймеров и флуоресцентных TaqMan зондов для выявления Babesia bigemina, Babesia major, Babesia occultans. К каждому возбудителю было подобрано по 2 пары праймеров и по два флуоресцентных TaqMan зонда. Расчетная температура отжига праймеров составляла от 58 до 62ºС, праймеры не образуют тугоплавкие димеры при проверке в PrimerSelect (Lasergene, DNASTAR). При проверке в PrimerBLAST, подобранные праймеры приводят к образованию соответсвеющих ПЦР продуктов только в Babesia bigemina, Babesia major, Babesia occultans.

Оптимизацию ПЦР с детекцией в режиме реального времени для выявления и видовой идентификации превалирующих патогенных видов Babesia spp проводили по температуре отжига праймеров и программе ПЦР циклирования, а также составу ПЦР реакции. Диапазон температурного градиента расчитывали на основании расчетной температуры отжига праймеров в PrimerBlast. При оптимизации выявили что оптимальная температура отжига праймеров для 3 пар праймеров составляла 60°С, 61ºС для 2 пар праймеров и 59ºС для 1 пары праймеров.