Экспрессию генов удалось проанализировать в отдельных клетках

Шведские ученые разработали методику, позволяющую выделять из образца ткани отдельные клетки и анализировать в них экспрессию генов. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Communications.

Сотрудники Каролинского института использовали комбинацию двух методов: лазерной захватывающей микродиссекции (ЛЗМ, LCM) и полного транскриптомного анализа с помощью технологии секвенирования РНК Smart-seq2. Принцип ЛЗМ заключается в том, что с помощью микроскопа в образце ткани выбирают интересующую клетку,после чего образец накрывают прозрачной пленкой и лазером «приклеивают» к ней интересующую клетку, не разрушая ее. Smart-seq2 позволяет синтезировать на основе матричных РНК (мРНК) единственной клетки полноразмерные комплементарные ДНК (кДНК), которые затем усиливают методом ПЦР и секвенируют.

Сочетание ЛЗМ с анализом транскриптома использовали и ранее,однако такие методики требовали от 200 до 4000 клеток для получения достаточного количества РНК для анализа. Однако в ряде случаев необходимо оценить разницу в экспрессии генов между отдельными схожими клетками в небольшом образце ткани. ПрименениеSmart-seq2 и нескольких усовершенствований комбинированной методики позволило ученым с достаточной точностью оценить транскриптом единичных клеток.

В ходе работы исследователи приготовили 12-микрометровые срезы ткани спинного мозга новорожденных мышат и визуализировали в них двигательные нейроны специальным красителем. При этом они успешно использовали нестандартный дорогостоящий набор реактивов, а фиксировали клетки обычным обезвоженным этанолом. Выделенные с помощью ЛЗМ отдельные клетки подвергали прямому лизису гипотоническим раствором и без экстракции и очистки РНК,необходимых для стандартных методик секвенирования, проводили Smart-seq2.

Эксперимент начали со 120 нейронов, постепенно снижая их количество до 50, 30, 10, 5, 2 и 1 клетки. Выяснилось, что выход кДНК при использовании прямого лизиса 50, 30 и 10 клеток сопоставим с результатами экстракции РНК и даже позволяет выделить из единицы образца в среднем больше генов (по мнению исследователей, это происходит из-за потери части генетического материала в ходе очистки РНК). Более того, новая методика,названная LCM-seq, обеспечила уровень успешного полно транскриптомного анализа в62 процента для одной клетки, 81 процент для двух клеток и 100 процентов для образцов, содержащих пять и более клеток.

Эффективность LCM-seq подтвердили, выявив с ее помощью разницу в экспрессии генов у близких по структуре и функциям двигательных нейронов из разных участков спинного мозга мыши. После этого, используя методику,ученые успешно определили разницу транскриптомов схожих мотонейронов из посмертных образцов спинного мозга больных боковым амиотрофическим склерозом, а также черной субстанции и вентральной покрышечной области головного мозга пациентов с болезнью Паркинсона.

Таким образом, LCM-seq подходит для анализа экспрессии геновв отдельных клетках даже в крайне малых или частично разложившихся образцах тканей, пишут исследователи. Один из них, Цяолинь Дэн (Qiaolin Deng), отметил, что она проще, дешевле и обладает гораздо большей чувствительностью и воспроизводимостью, чем существующие методики. По мнению ученых, их разработка может найти широкое применение в различных областях биологии и медицины, в том числе в изучении развития рака и идентификации его биомаркеров.

Автор: Олег Лищук

Конец формы

Источник(и): nplus1.ru

Share

Біз туралы

Елдің биотехнология саласын мемлекеттік қолдау және дамыту саясатын іске асыратын жетекші биологиялық ғылыми орталық - «Қазақстан Республикасы Білім және ғылым министрлігінің Ғылым комитеті «Ұлттық биотехнология орталығы» республикалық мемлекеттік кәсіпорны (ҰБО) Қазақстан Республикасы Президентінің Жарлығымен 1993 жылы құрылды. Орталық биотехнология, биологиялық қауіпсіздік және экология саласындағы мемлекетпен қаржыландырылатын ғылыми-техникалық бағдарламаларды орындайды және үйлестіреді.

Соңғы жаңалықтар